耐低温淀粉酶产生菌Y89微波诱变及发酵工艺

习彦花， 崔冠慧， 张丽萍， 李 欣， 张根伟， 程辉彩

(河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081)

耐低温淀粉酶产生菌Y89微波诱变及发酵工艺

习彦花， 崔冠慧， 张丽萍， 李 欣， 张根伟， 程辉彩*

(河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081)

为进一步提高耐低温淀粉酶产生菌的发酵生产水平，以前期筛选得到的1株耐低温兼性厌氧淀粉酶产生菌Y89为出发菌株，对其进行微波诱变处理，通过酶产量及遗传性能稳定检测筛选高活力突变株，并采取单因素优化法对菌株的培养基和培养条件进行优化。获得1株遗传稳定的高活力突变株Y89-11，淀粉酶产量达750.2 U/mL，是原出发菌株的1.94倍。采用单因素实验确定该突变株的最佳发酵条件：最适生长及产酶温度为16 ℃，最佳产酶时间60 h，最优碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母膏，培养基中添加Ca2+可显著提高产酶量。经诱变选育出的突变株Y89-11与原菌株相比产酶量提高了94%，所产淀粉酶为中低温酶，最适反应温度30 ℃，耐低温效果较好，应用前景广阔。

耐低温；淀粉酶；微波诱变；多粘类芽胞杆菌；发酵工艺

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，用途广、产量大，目前生产的淀粉酶商品大多为中高温淀粉酶。随着研究的深入和生产需求的提高，能够在低温、高盐等逆境下仍保持较高活力的酶产品近年来受到越来越广泛的关注。低温淀粉酶由于具有反应温度低、对热敏感等特点，有着中、高温淀粉酶无法取代的优越性，尤其是在洗涤产品、食品制造和环境工程等领域的潜在应用价值巨大。国内外学者对产低温淀粉酶微生物的筛选和研究报道也越来越多[1-3]。张刚等[4]、王晓红等[5]分别从黄海海域、福建沿海及新疆高海拔地区分离出产低温淀粉酶的微生物，并对其进行了研究。现阶段所筛选得到产耐低温淀粉酶的菌株主要为芽胞杆菌和曲霉，最适温度30～60 ℃，但初始酶活力均不高，很难满足实际生产的需要[6-8]。因此，通过诱变选育、基因改造等手段进一步提高相关菌株发酵生产具有耐受低温、高盐等特性淀粉酶的能力成为淀粉酶的研究热点[9-12]。本研究以前期筛选得到的1株耐低温兼性厌氧淀粉酶产生菌Y89为出发菌株，采用微波法进行诱变处理，获得稳定性良好的高活力突变株Y89-11，并对其产酶条件进行考察和优化，进一步提高其产酶能力，为使其应用于工业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)Y89，由实验室自行分离并保存，耐低温兼性厌氧菌，淀粉酶初始酶活为386.13 U/mL。

1.1.2 培养基 曲丽苯蓝筛选培养基：氯化钠5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，可溶性淀粉10 g，曲丽苯蓝适量，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；半固体种子培养基：氯化钠5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，琼脂粉6 g，pH 7.2～7.4；液体发酵培养基：氯化钠5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，可溶性淀粉10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；水琼脂培养基：琼脂粉12 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 自然。

1.2 方法

1.2.1 诱变育种 ① 菌悬液的制备：取5 mL对数生长期的Y89菌株发酵液于10 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入无菌水9 mL，振荡洗涤，离心10 min，弃上清液。加入无菌水调节菌液浓度约1.0×107个/mL，振荡均匀。② 微波诱变：取1 mL对数生长期菌悬液用乙酸缓冲液(pH 7.0～7.5)稀释至10-3；分别在微波中(800 W，2 450 MHz)处理5、10、15、20、25 s；菌悬液适当稀释后，置于16 ℃培养箱内双层培养，计算致死率分别为50%、60%、70%、80%、90%时的诱变时间。③ 突变菌株筛选：取0.5 mL菌液涂布平板，倒曲丽苯蓝筛选培养基，上层倒水琼脂培养基，16 ℃培养。挑起透明圈直径和菌落直径比大于对照的进行液体发酵培养，通过酶活测定进行复筛。④ 遗传稳定性测定：选取的菌株连续传代8次，将每代菌株进行发酵，测酶活。

1.2.2 发酵条件优化 测定突变菌株Y89-11的生长曲线，分别采用单因素试验方法考察菌株生长时间、生长温度、碳氮源、盐浓度、初始pH、微量金属离子等发酵参数对产酶的影响，初步研究酶液最适反应温度、热稳定性等性质。

1.2.3 淀粉酶酶活力测定方法 反应时间为30 min，以1 mL酶液每分钟分解可溶性淀粉所生成的麦芽糖的量表示一个酶活单位，用“U/mL”表示。酶活力计算公式：

淀粉酶活力=

2 结果与分析

2.1 诱变选育结果

2.1.1 微波诱变 由图1可知随着诱变时间延长致死率增大，到25 s时致死率达到100%，不同微波诱变时间对菌株Y89的诱变效果不同，诱变时间在15 s时致死率为75.1%，正突变率较高，所以选取15 s作为微波诱变的最佳时间。

图1 微波对菌株Y89的诱变效应Fig.1 Mutagenic effect of microwave on strain Y89

2.1.2 高活力突变株选育 从添加有曲丽苯蓝的平板上，选出透明圈直径与菌落直径之比相差较大的菌株，每轮挑选10～15个效果好的突变株进行复筛，通过连续6轮微波诱变，得到诱变株Y89-11，菌株酶活由初始的(386.1±3.2) U/mL提高到(750.2±5.8) U/mL，结果见表1。

表1 各突变株的透明圈与菌落直径之比Table 1 The ratio of the diameter of the transparent circle and colony diameter of the mutant strain

注：“-”代表对照(初始酶活未增加)

2.1.3 突变株遗传稳定性 连续传代8次，将8代同时活化后接种到半固体种子培养基中培养24～36 h，再接种到液体发酵培养基中培养48 h后测定发酵液的酶活，结果表明突变株Y89-11产酶活力没有显著变化，P>0.05，可见该突变株遗传性能稳定。

表2 Y89突变株各代系的产酶活力Table 2 The activity of the Y89 mutant strains of the generation system

2.2 突变株发酵条件优化

2.2.1 生长曲线的测定 突变株Y89-11生长曲线的测定结果见图2。12 h前该菌株处于延缓期，12～48 h处于对数生长期，48～108 h处于稳定期，108 h后OD值下降，处于衰落期。

图2 突变株Y89-11生长曲线图Fig.2 Growth curve of Mutant Y89-11

2.2.2 发酵时间对产酶的影响 在其他条件不变的情况下，根据生长曲线选取不同培养时间的发酵液进行酶活力测定，结果见图3。菌株Y89-11接种后随培养时间延长酶活力逐渐升高，在稳定中期60 h时淀粉酶活性达到最高738.2 U/mL。继续培养72 h后，酶活力显著下降，这可能是在发酵后期由于发酵液中可利用的营养物质减少、产物及有害代谢物的形成不利于产酶所造成的，因此选择60 h为产酶最佳发酵时间。

图3 发酵时间对突变株Y89-11产酶的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the amylase production of Y89-11

2.2.3 生长温度对产酶的影响 将突变株Y89-11分别置于10、16、25、30、37 ℃培养箱培养60 h，测定其酶活，结果见图4。Y89-11培养温度为16 ℃时酶活最高达到803.85 U/mL，25、30 ℃培养时无显著性差异，相对酶活分别为85.17%、84.12%，37 ℃培养相对酶活较低，为34.38%。说明该菌适宜在偏低温条件下产酶。

图4 生长温度对突变株Y89-11产酶的影响Fig.4 Effect of growth temperature on the amylase production of Y89-11

2.2.4 碳源的选择 考虑到发酵成本问题，选用几种常见碳源进行优化，将液体发酵培养基中的可溶性淀粉分别用10 g的糊精、葡萄糖、麦芽糖、玉米粉、蔗糖、乳糖替代，16 ℃静置培养，采用DNS法测定酶活，结果见表3。结果显示突变株Y89-11的碳源为可溶性淀粉时产生的酶活最高，达706.96 U/mL；其次为乳糖、玉米粉；麦芽糖最低，相对酶活仅为14.27%。淀粉酶作为一种外分泌型的胞外酶，其产生可能也需要一定的诱导作用，虽然其他几种糖容易被微生物利用，有利于微生物的生长，但对于产生淀粉酶却不是最佳碳源。

表3 碳源对突变株Y89-11产酶的影响Table 3 Effect of fermentation time on the amylase production of Y89-11

2.2.5 氮源的选择 为考察有机氮源和无机氮源对菌株产酶的影响，分别选取蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、硫酸铵、氯化铵作为氮源，碳源为2%的可溶性淀粉，其他条件相同，16 ℃培养箱培养60 h，采用DNS法测定酶活，结果见表4。有机氮源比无机氮源更有利于菌株产酶，其中酵母膏为最优氮源，突变株Y89-11酶活最高可达723.62 U/mL；其次为牛肉膏、豆饼粉；硫酸铵和氯化铵为氮源时，相对酶活仅为16.87%、23.42%。

表4 氮源对突变株Y89-11产酶的影响Table 4 Effect of fermentation time on the amylase production of Y89-11

2.2.6 最适NaCl浓度 将液体发酵培养基中的NaCl质量分数范围分别调至0～10%，测定酶活结果见图5。结果显示，突变株Y89-11在设定NaCl质量分数范围均能生长。当NaCl质量分数为2%时，酶活达到最高为658.43 U/mL，其次分别为4%、5%。

2.2.7 最适培养初始pH 结果见图6，突变株Y89-11在pH为5.0～9.5的范围内均生长，在pH范围6.5～7.5之间酶活较高。pH为7.0时酶活达到最高，其次为7.5、6.5，相对酶活分别为95.15%、85.84%。

2.2.8 金属离子对突变株Y89-11产酶的影响 在培养基中分别添加1 mmol/L的Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、K+，测定发酵液酶活，结果见图7。Fe2+、Mn2+、Zn2+、K+对菌株突变株Y89-11无显著影响，Mg2+、Al3+抑制淀粉酶的产生，其中Al3+的抑制作用最明显(相对酶活为18.4%)，Ca2+起促进作用(相对酶活为117.47%)。

图5 NaCl对突变株Y89-11产酶的影响Fig.5 Effect of salt concentration on the amylase production of Y89-11

图6 初始pH对突变株Y89-11产酶的影响Fig.6 Effect of initial pH on the amylase production of Y89-11

图7 金属离子对突变株Y89-11酶活的影响Fig.7 Effect of metal ion on the amylase production of Y89-11

2.3 酶学性质的初步研究

2.3.1 酶反应最适温度 粗酶液稀释一定倍数，与底物在不同温度下进行反应，温度梯度设置为10、20、30、40、50、60、70、80 ℃，在这些条件下测定酶活，测得淀粉酶活性最大值为100%。图8表明该酶反应的最适温度为30 ℃，20～50 ℃间相对酶活80%以上，属于中低温酶。

2.3.2 酶的热稳定性 将酶液分别置于10、20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴锅保温预处理60 min，30 ℃测其剩余酶活，以不保温酶液为对照，对照相对酶活值为100%，结果见图9。突变株Y89-11酶液20 ℃保温预处理60 min，酶活性基本没有损失，30 ℃保温预处理60 min，对酶活性有一定刺激作用，相对酶活达137.5%。20～40 ℃间能保持90%以上的酶活，50 ℃保温预处理60 min相对酶活62.3%，温度大于60℃酶活下降为零，说明该酶为中低温酶，耐低温效果较好。

图8 反应温度对酶活性的影响Fig.8 Effect of reaction temperature on enzyme activity

图9 突变株Y89-11产酶热稳定性Fig.9 Thermal stabilization of the amylase produced by Y89-11

3 讨 论

微波诱变是微生物育种中较为常用的方法，本研究首次对筛选的野生型耐低温淀粉酶产生菌多粘类芽胞杆菌Y89进行微波诱变处理，筛选得到高活力突变株Y89-11，淀粉酶产量达750.2 U/mL，酶活是出发菌株的1.94倍。通过对突变株Y89-11最佳发酵条件和酶学特性的初步研究，结果表明该菌株是一株耐低温产淀粉酶菌株，生长pH范围较宽，所产淀粉酶为中低温酶。

本研究建立了耐低温淀粉酶产生菌种微波诱变选育的系统方法，经过培养基配方优化筛选及发酵工艺参数控制，确立了该突变株生产低温淀粉酶的最佳工艺条件。该菌株发酵生产出的低温淀粉酶具有较好的低温活性、酶活高。这些特性决定了该菌株可应用于纺织、食品、洗涤剂、环境工程等领域，在开发适用于工业生产的新型酶制剂，甚至在不同pH值的污水处理中也可发挥相应作用，在减少对环境的污染，保护人类生态环境安全等方面有较大的应用价值[13-15]。此外本研究主要进行了耐低温淀粉酶单纯的微波诱变及选育工作，后续将结合紫外线、激光、等离子等方法进行复合诱变。另外，该突变株的遗传稳定性还需在今后的实际生产应用过程中做进一步探讨和研究。

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Microwave Mutagenesis and Fermentation Technology of Cryo-Resisting Amylase Producing Stain Y89

XI Yan-hua, CUI Guan-hui, ZHANG Li-ping, LI Xin, ZHANG Gen-wei, CHENG Hui-cai

(Biol.Inst.,HebeiAcad.ofSci.,Shijiazhuang050081)

In order to improve the fermentation and production level further of cryo-resisting amylase producing strain, to provide premium strain seed germplasm resources for the production of cryophilic amylase, a previously screened cryophilic anaerobic amylase producing strain Y89 was taken as starting strain, and waged microwave mutagenetic treatment. And the highly active mutant strain with high amylase output and performance genetically stable was screened through test and determination, and the medium and culture conditions were optimized adopting single factor optimization. The results showed that a genetically stable and highly active mutant strain Y89-11 was obtained, the amylase output was as high as 750.2 U/mL. 1.94 times of the starting strain. The optimal fermentation conditions for the strain was optimized adopting single factor experiment, the most suitable temperature for growth was at 16 ℃, the best enzyme producing time was 60 h, the best carbon source was soluble starch, nitrogen source was yeast extract, the addition of Ca2+could significantly increase the output of the enzyme. Therefore, as compared with the original strain, the mutant strain Y89-11 bred by mutagenesis the amylase production increased by 94%, and the amylase it produced was a medium-low temperature enzyme with optimal reaction temperature at 30 ℃, the resistant effect to low temperature is good, and the application prospect is wide.

cryo-resistant； amylase； microwave mutation；Paenibacilluspolymyxa； fermentation technology

河北省科技支撑项目(14222901D，14273801D)；河北省财政预算项目(15302)

习彦花 女，助理研究员，硕士。主要从事应用微生物方面的研究。Tel：0311-83014879，E-mail：xiyanhua86@163.com

* 通讯作者。女，副研究员，博士。主要从事生物质能源方面的研究。Tel：0311-83014879，E-mail：huicaicheng@163.com

2015-12-02；

2016-01-16

Q556+.2

A

1005-7021(2016)05-0021-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.004