鼠胚胎成纤维细胞三维培养修复大鼠全层皮肤缺损的效果及其机制

陈凤超+陈民才+颜彤彤

[摘要] 目的 观察鼠胚胎成纤维细胞三维培养修复大鼠全层皮肤缺损的效果，并对其机制进行分析。 方法 采用组织块法培养鼠胚胎成纤维细胞，将鼠尾胶原溶液和以血清重悬的鼠胚胎成纤维细胞溶液混合后形成凝胶构建组织工程皮肤，移植于大鼠背部全层皮肤缺损创面。实验组30只全层皮肤缺损大鼠采用组织工程皮肤进行修复。对照组30只全层皮肤缺损大鼠不做任何处理。两组创面分别进行HE染色和免疫组织化学染色，计算微血管密度，观察其愈合过程。 结果 术后20 d实验组用组织工程皮肤覆盖的大鼠背部创面已完全愈合，新生上皮外观与结构和正常皮肤相似；对照组创面仍有痂皮覆盖，去除痂皮可见肉芽组织红润致密，创面周围新生上皮呈粉红色，边缘锐利皱缩。实验组创面组织中CD31表达及微血管密度均明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 鼠胚胎成纤维细胞三维培养对动物皮肤全层缺损的修复有很好的效果，在修复皮肤损伤方面具有良好的临床应用前景。

[关键词] 胚胎成纤维细胞；三维培养；皮肤缺损；微血管密度

[中图分类号] R641 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of three dimensional culture of rat embryonic fibroblasts in the treatment of full-thickness skin defect in rats. Methods Full-thickness skin wound was created on the back of rats. Tissue block method was used to culture rat embryonic fibroblast cells. The rat embryonic fibroblast cells resuspended in serum were mixed with tail collagen solution to structure tissue engineered skin. In the experimental group， full thickness skin defect rats （n=30） were transplanted with tissue engineered skin in the wound area. In the control group， full-thickness skin defect rats （n=30） were not given any special treatment. The microvascular density was calculated and the healing process was observed by HE staining and immunohistochemistry method. Results 20 d after operation， in the experimental group the wound areas transplanted with tissue engineering skin on the back of rat were completely healed； the appearances and structures of newborn epithelium were similar to the normal skin. The wounds of the control group did not show healing and were covered with scar； removing scab skin visibled granulation tissues were ruddy and compact； there were pink wounds around new epithelium， and shrinkage around tissue edges. In the experimental group， and the expression of CD31 and microvessel density in wound tissues were significantly higher than those in the control group （P < 0.05）. Conclusion Three dimensional culture of rat embryonic fibroblast cells has good curative effect for repairing the whole layer of skin defect in rats. This culture method may have a good clinical application prospects in the repair of skin damage.

[Key words] Embryo fibroblast； Three-dimensional culture； Skin defect； Microvessel density

皮肤是体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭的屏障。皮肤软组织缺损严重可导致皮肤自我修复困难，经久不愈，感染，甚至危及生命。目前临床上主要采用自体皮肤移植或自体异体混合移植进行修复[1-3]，异体皮肤移植容易产生免疫排斥，严重影响创面修复效果。成纤维细胞胶原凝胶（fibroblast populated collagen gel）是指用胶原溶液制备凝胶，对成纤维细胞进行三维立体培养而形成的一种修复皮肤破损的体外模型。该模型在结构和功能上都和皮肤的真皮层非常相近，有利于修复创面及改善预后效果[4-6]。本研究将成纤维细胞三维培养作为真皮替代物观察对大鼠全层皮肤缺损修复的效果，为成纤维细胞胶原凝胶在皮肤组织工程及临床中的应用提供了进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

孕龄16～19 d的SD大鼠10只；雄性SD大鼠60只，5月龄，体重200～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要仪器

VD-1320洁净工作台（德国Hermle），3111CO2培养箱（美国Thermo），倒置生物显微镜（北京市半导体设备厂），培养皿，手术刀柄、刀片，巾钳，持针器，有齿镊，药杯，弯盘，缝合针，蚊式钳，消毒钳，剪刀，眼科剪，眼科镊，缝合线等。

1.3 主要试剂及药品

DMEM培养基、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清，均购于美国GIBCO公司；人IL-6、TGF-β1 ELISA试剂盒，购于北京达科为生物技术有限公司；苏木精染色液、伊红染色液，购于广州市欣源贸易有限公司，批号分别为474077、C0109。

1.4 方法

1.4.1 成纤维细胞培养 将10只处于妊娠16～19 d的大鼠处死，酒精浸泡消毒，无菌条件下分离胚胎，取鼠胚胎皮肤，用含双抗的PBS清洗2～3次，将皮肤切成1～1.5 mm2小块。用镊子将切好的组织块贴到培养瓶内，在CO2孵箱内孵育4 h，加入少量培养基继续孵育24 h，然后将培养基加至正常量，隔2 d换1次液，当成纤维细胞达到60%～70%，传代培养。

1.4.2 鼠尾胶原制备 将上述处死的大鼠的尾部剪下，用75%乙醇浸泡消毒30 min，在无菌条件下抽出肌腱，用生理盐水反复冲洗，剪碎，置于0.1%乙酸溶液中浸泡48 h。4℃低温离心（10 000 r/min，30 mim）后取上清。放置在4℃冰箱过夜，取出后用0.1 mol/L NaOH调pH值，用100 g/L氯化钠溶液反复盐析，离心（1000 r/min，5 min）弃上清。用0.1%的乙酸溶解，保存在4℃冰箱备用。

1.4.3 成纤维细胞胶原凝胶制备 取上述第5代鼠胚胎成纤维细胞，对数生长期时用胰蛋白酶37℃消化10 min，加入小牛血清终止反应，20℃离心（1000 r/min，5 min）弃去上清液，加DMEM培养基制成单细胞悬液，细胞浓度为2×1010个/L。细胞悬液∶5×DMEM∶胶原溶液按1∶2∶7比例混匀，用0.1 mol/L的NaOH调pH为6。置于35℃培养箱孵育10 min，再加入适量的完全培养基，于培养箱中继续孵育培养。

1.4.4 全层皮肤缺损模型制备及分组 SD雄性大鼠称重，腹腔注射3.5%水合氯醛（0.01 mL/g）麻醉。背部术区去毛，碘伏消毒，用眼科剪在背部中央剪去一个1 cm×1 cm大小的创面，制成全层皮肤缺损模型。根据皮肤修复方法不同将实验大鼠分为两组，每组30只。实验组动物采用胚胎成纤维细胞胶原凝胶移植修复，对照组动物不做处理。各组创面均用纱布覆盖。

1.5 指标检测

对SD雄性大鼠背部造成全层皮肤缺损，分别在修复治疗后5、10、15、20 d观察各组大鼠皮肤愈合情况，愈合率=（原始创面面积-未愈合的创面面积）/原始创面面积×100%，拍照记录。术后5、10、15、20 d各处死大鼠6只，取创面组织，冰冻切片，一组进行HE染色，并于显微镜下观察。另一组石蜡包埋，切0.5 μm薄片，用抗CD31单克隆抗体对皮肤组织标本进行免疫组化染色。先用低倍光学显微镜观察，选择CD31阳性表达密度较高的6个区域，在高倍镜下计数血管数，计算微血管密度（micro vessel density，MVD），即每平方毫米的微血管数目。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面愈合情况

实验组（胚胎成纤维细胞胶原凝胶）修复的创面在术后5、10、15、20 d各个时间点的愈合率均高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），见表1。术后5 d，实验组创面无感染，对照组出现红肿、感染等不良反应。术后10 d，实验组创面边缘呈粉红色，新生肉芽红润、致密，触之易出血，可见上皮生长明显加速；对照组创面周围红肿，有白色脓苔覆盖，去除脓苔可见苍老水肿肉芽组织，创面边缘圆钝，新生上皮爬行不明显。术后15 d，实验组创面明显缩小，新生上皮呈粉白色，发亮，肉芽新鲜红润致密；对照组创面有所缩小，仍有白色脓苔覆盖，去除脓苔可见创面边缘较圆钝，肉芽水肿。术后20 d，实验组创面基本愈合，个别可见干燥痂皮，周围上皮皱缩并可见有细毛长出；对照组创面明显缩小，创面肉芽组织红润致密，创面周围新生上皮呈粉红色，边缘锐利皱缩。

2.2 HE染色结果

术后5 d，实验组大鼠愈合处标本显示有大量纤维细胞、微血管分布，并分泌大量胶原；对照组创面无明显修复现象，部分有炎性反应。术后10 d，实验组大鼠创面可见新生皮肤附属器及各层结构开始分化，胶原纤维排列紧密；对照组胶原纤维排列疏松，胶原分泌少。术后15 d，实验组创面表皮层次清晰，皮肤附属器及各层结构新生分化完全；对照组胶原纤维排列紧密，胶原分泌增多，皮肤结构与周围正常皮肤相似。术后20 d，实验组创面可以观察到表皮的基底层、颗粒层和角质层；对照组创面亦可见大量纤维细胞和胶原，但各层新生结构都处于修复阶段。见图1（封三）。

2.3 创面组织血管内皮细胞CD31表达及微血管密度

术后5 d，实验组CD31阳性细胞围成很多大小不一的血管腔，对照组部分血管腔呈类圆形，部分无明显管腔。术后5、10、15、20 d各时间点实验组创面组织微血管密度较对照组明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2（封三）、表2。

3 讨论

目前研究的组织工程皮肤和生物敷料种类繁多，存在着耐磨性差、免疫排斥、培养时间长、治疗费用昂贵等突出问题[7-8]。本研究在前人研究的基础上，体外扩增同种异体鼠胚胎成纤维细胞作为种子细胞进行三维培养，并用来修复鼠皮肤缺损，同时观察其治疗效果，这可能是一条修复皮肤缺损行之有效的途径[9]。

成纤维细胞胶原凝胶是指用胶原溶液制备凝胶，对成纤维细胞进行三维立体培养而形成的一种组织样结构。鼠胚胎成纤维细胞易于获取，可以在体外进行大规模培养，并有性质稳定、增殖力强、持续分泌、抗原性低等优点，是非常理想的组织工程种子细胞[10-11]。胶原是存在于结缔组织并由三条肽链形成的螺旋状纤维状蛋白，是细胞外基质、动物韧带以及肌腱的主要组成部分，具有无毒、无害、生物相容性好、降解产物可被肌体吸收等优点[12]。临床与实验证明胶原有促进表皮细胞生长、引导上皮细胞长入损伤区、促进细胞再生和皮肤组织合成代谢的作用[13-14]，其主要作用机制是胶原（蛋白）含有细胞代谢所需要的必需氨基酸，可以加速成纤维细胞增殖分化，并且其三维空间结构可以在细胞迁移时起支持和润滑的作用[15-16]。除此之外，使用成纤维细胞胶原凝胶覆盖伤口，可以加速局部皮肤的血管化速度，促进血液循坏和新陈代谢，从而有利于缺损皮肤的修复[17-19]。

体内细胞的生长环境都是三维的，是细胞与细胞、细胞与细胞间质相互作用形成的一个和谐统一的整体。所以，三维培养的细胞才能够更合理地反映体内细胞的生物学特征[20]。三维细胞培养复合物更加接近皮肤的天然结构，更有利于皮肤创伤的修复。本实验对鼠胚胎成纤维细胞三维培养修复大鼠全层皮肤缺损进行研究，结果表明，三维培养的成纤维细胞依附于鼠胶原纤维可较好地修复皮肤破损，愈合率高，术后20 d创面基本愈合，无免疫排斥，而对照组大鼠术后都不同程度出现皮肤红肿、感染、肉芽组织苍老水肿、上皮生长明显缓慢等问题。实验组的新生血管MVD值术后各时间点均明显高于对照组（P < 0.05）。对照组创面愈合迟缓，分析新生血管化障碍和/或延迟可能是其难以愈合的重要原因之一；而实验组胚胎成纤维细胞组织工程皮肤可以促进创面内残存的血管内皮细胞增殖、分化、迁移，促进创面血管化，使得局部血供增加，抗感染能力明显加强，从而加速创面愈合。通过HE染色可以看出，移植的胚胎成纤维细胞在体内能够继续分泌胶原和细胞生长因子，促进毛细血管的生成，刺激成纤维细胞增殖和分化，从而有利于肉芽组织形成，进而加速创面愈合。本研究为成纤维细胞胶原凝胶在皮肤组织工程及创伤整形外科中的应用提供了进一步的理论依据。

[参考文献]

[1] 尹凯，申传安，马丽，等.自体表皮细胞悬液移植修复全层皮肤缺损创面的动物实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2016，30（2）：219-223.

[2] 吕淑坤.表皮干细胞在组织工程创面修复中的应用[J].中国组织工程研究，2012，16（27）：5126-5130.

[3] 孙宁，黄益洲，张忆，等.人胎盘蜕膜基层来源MSCs参与大鼠皮肤创面修复的研究[J].中国修复重建外科杂志，2016，30（5）：631-637.

[4] Alastair S， Garfield. Derivation of Primary Mouse Embryonic Fibroblast（PMEF）Cultures [M]. New Jersey：Humana Press，2010，6（33）：19-27.

[5] 于姝媛，王苹，汤勇，等.成纤维细胞/胶原凝胶复合支架促进中耳黏膜上皮细胞的增殖[J]. 中国老年学杂志，2015， 35（20）：5730-5732

[6] 胡三强，王妍妍，马永宾，等. 小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备[J].中国组织工程研究，2014，18（45）：7306-7311.

[7] 梁文清，周国芳，钱宇，等.多孔微球种子细胞储库型组织工程肌腱支架体外构建[J].中国中医骨伤科杂志，2016， 24（1）：9-12.

[8] 阮洪江，李来峰，范存义，等.Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用[J].中国矫形外科杂志，2016，24（5）：448-454.

[9] 刘辉辉，郭善禹.皮肤组织损伤修复的研究进展[J].外科理论与实践，2013，18（2）：188-192.

[10] Kim HS，Heo JI，Park SH，et al. Transcriptional activation of p21（WAF1/CIP1）is mediated by increased DNA binding activity and increased interaction between p53 and Sp1 via phosphorylation during replicative senescence of human embryonic fibroblasts [J]. Molecular Biology Reports，2014，41（4）：397-408.

[11] 王敏，薛晓东，谢沛霖，等.局部应用NGF-胰岛素复合凝胶对糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复的影响[J].中国修复重建外科杂志，2013，27（2）：182-188.

[12] Rath G，Hussain T，Chauhan G，et al. Collagen nanofiber containing silver nanoparticles for improved wound-healing applications [J]. Journal of Drug Targeting，2015，24（6）：1-10.

[13] Thoma CR， Zimmermann M，Agarkova I，et al. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery [J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2014，69（70）：29-41.

[14] Silva EJNL，Senna PM，De-Deus G，et al. Cytocompatibility of Biodentine using a three-dimensional cell culture model [J]. International Endodontic Journal，2015， 49（6）：74-80.

[15] Mccorry MC，Puetzer JL，Bonassar LJ. Characterization of mesenchymal stem cells and fibrochondrocytes in three-dimensional co-culture： analysis of cell shape， matrix production， and mechanical performance [J]. Stem Cell Research&Therapy，2016，7（1）：1-10.

[16] Michiya M，Charles PC，Mitsuru A. Three-dimensional cell culture technique and pathophysiology [J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2014，7（74）：95-103.

[17] 雷静，刘旭昭，陈淡嫦，等.凝胶型胶原敷料修复糖尿病皮肤缺损及促进血管再生[J].中国组织工程研究，2014， 18（52）：8456-8462.

[18] 董丽，马绍英，徐勇杰，等.同基因细胞源组织工程皮肤修复皮肤缺损的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2012，26（11）：1375-1380.

[19] 王敏，兰亚，胡皓，等.以胶原水凝胶为支架构建肝细胞三维培养系统[J].中国组织工程研究，2013，17（29）：5323-5330.

[20] 邓鑫，罗茂，李蓉，等.血管周细胞在肿瘤血管生成和转移过程中的作用研究进展[J].中国肿瘤临床，2013，40（8）：483-485.

（收稿日期：2016-07-05 本文编辑：程 铭）