清香木内生菌对酪氨酸酶活性的影响

李洪文　聂奇华　李光富　张明　邹云川

【摘 要】 目的：探讨清香木内生菌对酪氨酸酶活性的影响。方法：对新鲜清香木的茎和根部位进行内生真菌的分离，经显微鉴定菌株分别为木霉属、镰孢属和假丝酵母属，然后将菌株的发酵液用多孔酶标板法进行酪氨酸酶抑制活性的检测。结果：茎皮部的PZ-6-2对酪氨酸酶活性抑制作用最强，PZ-4次之；根皮部的QZ-1抑制活性也较强。结论：清香木内生菌对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用。

【关键词】 清香木；内生真菌；酪氨酸；酪氨酸酶抑制剂

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0018-01

Abstract：Objective To discuss the effect of endophytes from Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch on tyrosinase activity.Methods The endophytic fungi isolated from stems and roots of fresh Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch were belong to trichoderma， fusarium and candida through microscopic identification respectively， and next the inhibitory effect of strain fermented liquid on tyrosinase was determined.Result The PZ-6-2 from stem bark and QZ-1 from root bark had a stronger inhibitory effect on tyrosinase，and the effect of PZ-4 is weak.Conclusion The Endophytic fungi from Pistacia weinmannifolia J.Poisson ex Franch had a certain inhibitory effect on tyrosinase activity.

Keywords：Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch； Endophytic fungi； Tyrosine； Tyrosinase inhibitors

植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内且不引起植物明显病害的微生物[1]。研究表明，某些药用植物的内生菌可以产生与寄主相似的作用。清香木（Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch），别名香叶树、清香树等，为漆树科黄连木属植物，主要分布于云南中部、北部及四川南部等地。临床以叶及树皮入药，具有消炎解毒、收敛止泻的功效，并在美白和收缩毛孔方面有一定活性。酪氨酸酶又称多酚氧化酶（EC.1.14.18.1），广泛存在于微生物、动植物及人体中，是生物体合成黑色素等色素的限速酶[2]，与人的衰老、昆虫的伤口愈合与发育、果蔬的褐变有密切关系。近年来，酪氨酸酶一直受到国内外的关注，其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。本实验以清香木内生菌作为研究对象，以Kubo和Masuda的酪氨酸抑制模型[3-4]对代谢产物进行筛选。

1 仪器与材料

1.1 仪器 KHB ST-360酶标仪（上海科华）；Lambda 35紫外分光光度计（Perkin Elmer）；气浴恒温摇床（Thermo）；DZF-6050真空干燥箱（上海星业）；显微镜（奥林巴斯）。

1.2 材料 样本采自楚雄医药高等专科学校校园植物园，经鉴定为漆树科黄连木属植物Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch。

2 方法

2.1 内生真菌的分离鉴定

2.1.1 培养基的配制 平板和发酵用培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，加入1 L蒸馏水中，搅拌均匀备用。斜面培养基：用高氏1号（可溶性淀粉20 g， KNO3 1.0 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，纯化琼脂粉16 g，加入蒸馏水1 L，调整pH至7.4）。

2.1.2 内生真菌的培养分离 取新鲜清香木的茎和根，用自来水将表面冲洗干净，稍干后切成适宜长度的小段，在75 %乙醇中浸泡3～5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。然后用无菌刀片将组织表皮削去。分别取韧皮部、木质部并切成5 mm×5 mm×1 mm的小块贴放于分离培养基上，置25～28 ℃恒温箱中培养3～7 d，待培养基上各植物组织周围长出菌丝后，采用尖端菌丝挑取法对所分离的内生真菌进行纯化，即得内生真菌。

2.1.3 内生真菌的鉴定 参考文献[3]采用插片培养和点植法对分离获得的清香木内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，结果见表1。经鉴定，来源于清香木茎皮部的内生真菌为木霉属（PZ-6-2）和镰孢属真菌（PZ-4），来源于根皮部的为的假丝酵母属真菌（QZ-1）

2.2 酪氨酸酶活性的研究

2.2.1 检测样品的制备 按照“2.1配制”培养基，然后于超净工作台中将纯化后的菌种依次接种到装有灭菌液体培养基的试管中，标记后置入多孔泡沫板于摇床中28 ℃，160 r/min，5 d，发酵。

2.2.2 样品处理及检测 发酵后的液体于121 ℃，20 min灭活后，将上清液倾倒入7 ml的离心管中，12000 r/min离心5 min。取适量上清液至干净的试管中，标记后4℃保存。

对酪氨酸酶的抑制筛选参照Kubo和Masuda的方法并进行改进。反应在96孔细胞培养板中进行，共设4组，每组设3个复孔，分别为：Ⅰ.不含样品，但含酪氨酸酶的阴性对照，每孔加入180 μl磷酸盐缓冲液，20 μl 酶溶液。不含样品及酪氨酸酶的空白对照，每孔加入200 μl缓冲液。包含样品及酪氨酸酶，依次加入150 μl缓冲液，20 μl 酶溶液，30 μl样品。Ⅳ.含样品但不含酪氨酸酶的空白对照，每孔170 μl磷酸缓冲液，30 μl样品。然后将培养板在30 ℃下孵化5 min，并在每孔中加入100 μl酪氨酸酶溶液。30 ℃反应20 min后，于酶标仪中测量475 nm处的吸光度值。提取物对酪氨酸酶活性的抑制按公式计算：

抑制率=[（Ⅰ-Ⅱ）-（Ⅲ-Ⅳ）] / （Ⅰ-Ⅱ）×100 %

3 结果

3.1 对酪氨酸酶活性的抑制作用 通过参考Kubo的酪氨酸酶活性筛选模型，将分离得到的清香木内生真菌进行活性筛选，通过计算抑制率，进而作出筛选的标准。见表2。

4 讨论

通过分离清香木中内生真菌并进行活性筛选，建立了酪氨酸酶活性的筛选模型，筛选出活性较好的三株菌株。接下来将通过对此三株菌株的产物活性跟踪找到活性成分并进行分离鉴定，希望获得能够在食品保鲜、美白方面有益的产物。

参考文献

[1]Takakazu Kaneko，Kiwamu Minamisawa，Tsuyoshi Isawa， et al. Complete genomic structure of the cultivated rice endophyte Azospirillum sp.B510[J].DNA research，2010，17（1）： 37-50.

[2]Kubo I，Kinst-Hori I.Flavonols from saffron flower：tyrosinase inhibitory activity and inhibition mechanism[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（10）：4121-4125.

[3]Kubo I，Kinst-Hori I，Chaudhuri S K，et al.Flavonols from Heterotheca inuloides：tyrosinase inhibitory activity and structural criteria[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry， 2000， 8（7）： l749-1755.

[4]Masuda T，Yamashita D，Takeda Y，et al.Screening for tyrosinase inhibitors among extracts of seashore plants and identification of potent inhibitors from Garcinia subelliptica[J]. Bioscience ， Biotechnology， and Biochemistry，2005，69（1）：197-201.

[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

（收稿日期：2015.10.28）