孤儿肽在肺动脉高压大鼠中的表达

张洪亮,贾阿娜,刘春辉,王 慧,范 蕾,赵智敏,贺兆发

(1.佳木斯大学附属第一医院心内科，黑龙江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市急救中心，黑龙江 佳木斯 154002)



孤儿肽在肺动脉高压大鼠中的表达

张洪亮1,贾阿娜2,刘春辉1,王 慧1,范 蕾1,赵智敏1,贺兆发1

(1.佳木斯大学附属第一医院心内科，黑龙江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市急救中心，黑龙江 佳木斯 154002)

目的:探讨孤儿肽( orphanin FQ, OFQ)在肺动脉高压大鼠肺动脉组织及血浆中表达水平变化意义。方法:20只雄性SD大鼠随机分为肺动脉高压诱导组(n=15)和对照组(n=5)，肺动脉高压诱导组采用腹腔注射野百合碱( monocrotaline，MCT) 60mg/kg体重，对照组腹腔注射等体积的0.9%生理盐水。在注射野百合碱7、14、21、28d后，检测大鼠肺组织中mRNA的表达情况，并应用免疫组织化学技术定位OFQ在肺动脉组织中表达。结果:OFQ在肺动脉高压大鼠肺组织中表达随时间增加呈现正相关，同时在血浆中OFQ表达变化随着肺动脉高压进展而增加，OFQ表达变化与肺动脉血液动力学指标及右心室肥厚指数呈现明显相关性，免疫组化显示OFQ定位于肺小动脉的内皮细胞及平滑肌细胞。结论:OFQ在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠血浆及肺动脉中表达升高，它可以作为判定肺动脉高压严重程度的重要指标，可能参与肺动脉高压发病血管重塑机制。

肺动脉高压；孤儿肽；大鼠；野百合碱

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一类以肺动脉压力和肺小血管阻力进行性增加为特征的临床病理综合征，往往伴有右心衰竭，肺血栓形成及血液动力学变化，严重者会危及生命[1]。肺小动脉血管重构是其主要病理改变，重构的主要表现为：肺动脉血管内皮细胞及平滑肌细胞过度增殖，一些无肌小动脉出现肌层样改变，同时伴有肺组织纤维化、炎症浸润及血栓形成。

孤儿肽( orphanin FQ, OFQ )或称痛敏肽( nociceptin ) ,是一类与阿片肽具有高度同源的肽类物质，OFQ最早从大鼠和猪的脑组织中分离得到的一种新的17肽，实验证明孤儿肽为阿片样受体的内源性配体[2]。OFQ前体在中枢神经系统组织中具有广泛的表达，近年来发现在其他器官如肾脏、脾以及生殖系统中存在表达。McDonald 研究发现OFQ主要表达于冠状动脉粥样硬化的动脉组织，同时在发生心力衰竭时候也有表达，但心肌组织中没有明显的表达[3]。

目前关于OFQ在肺动脉高压中的表达情况尚无报道，本研究对MCT诱导的PAH大鼠肺动脉及血浆中OFQ变化进行探究，进一步观察PAH肺组织及肺动脉中是否具有OFQ分布，并为OFQ参与血管重构及血管效应机制研究提供初步参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

MCT(Sigma公司)，TRIZOL(Takara公司)，大鼠OFQ酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 检测试剂盒(Linco公司)，PCR引物(Invitrogen 公司), AMV 逆转录试剂盒 (Promega 公司), Power SYBR green PCR master mix (ABI 公司)， Anti-Nociceptin抗体(ab100880)。

1.2 肺动脉高压动物模型制备及样本采集

健康SD大鼠20只，雄性，体重260～300g(8周龄)，被随机分成正常对照组(control 组n=5)和秋水仙碱诱导组(MCT组n=15)，MCT组采用2% MCT以60mg/kg剂量SD大鼠一次性腹腔注射， control组采用等量生理盐水SD大鼠腹腔注射，正常饲养4w。在注射MCT后分别于7、14、21、28d进行血液动力学监测(右心导管法)，检测指标包括：右室收缩压、肺动脉收缩压、平均肺动脉压，测量评估右心室肥厚指数，评估肺动脉高压严重程度。收取实验大鼠血浆标本，分装后冻存于-80℃冰箱，留取肺组织迅速冻存于液氮之中备用。

1.3 免疫组化染色实验

肺组织应用福尔马林固定后石蜡包埋制成蜡块，切片，贴片后以PBS清洗3遍，每次5min，进行高压修复；Triton X-100孵育20min，滴加封闭液，37℃ 封闭30min，加入Anti-Nociceptin抗体(ab100880)(1:200)，4℃过夜，PBS洗3次，每次5min，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶500) ，室温孵育2h;PBS 洗3 次，每次5min，加入ABC复合物，室温孵育2h;PBS洗3次，每次5min，用蒸馏水迅速冲3 次; DAB 显色，PBS终止显色。梯度酒精进行脱水，封片后拍照。

1.4 OFQ在肺组织mRNA表达检测

实时荧光定量聚合酶链式反应( real time PCR，RT-PCR)取冻存肺组织约100mg，应用Trizol法提取总RNA，应用NanoDrop 2000进行RNA定量，各组RNA样品的A260 /A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之间。将2μg 的总RNA反转录成相应的cDNA。根据据已发表文献的OFQ前体cDNA核甘酸序列引物序列[4]，由Invitrogen公司合成引物如下: 正义链引物(sense primer)为: 5′-T GGATCCCACGGCTGCACCATGAA-3′，反义链引物( anti sense primer)为: 5′-GAATTCGGCTCCTTCTGGCT ACACATTAC-3'；内参为GAPDH: 正义链引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，反义链引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。RT-PCR反应条件：反应条件是：95℃ 30s预变性，95℃ 10s变性和60℃ 30s退火及延伸，进行40个循环。每个PCR反应进行三个重复，使用ABI Real-time PCR仪(Applied Biosystems)运行程序，结果使用2(-ΔΔCT)计算方法进行数据分析。

1.5 ELISA法检测大鼠血浆中OFQ浓度

MCT诱导大鼠肺动脉高压血浆OFQ浓度使用Linco公司的试剂盒，按照说明书中操作步骤进行，试验重复3次。及具体方法：用包被缓冲液将抗体稀释后加入96孔板4℃过夜，次日弃掉孔内溶液，应用TBST冲洗后加入样品100μL，37℃孵育1h，各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL,37℃孵育1h，洗涤。底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，37℃30min，于各反应孔中加入2M硫酸50μL终止反应。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，连续变量应用平均数±标准差表示，one-way ANOVA 来进行方差分析及显著性检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 OFQ的mRNA在MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织RT-PCR的表达

MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织中OFQ mRNA表达变化，应用RT-PCR检测MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织中OFQ mRNA表达情况，与control组比较结果显示：MCT诱导PAH组在14d出现OFQ表达升高，时间的增加呈现逐步升高。分析结果显示：在14天时候OFQ的表达量(fold change)为control组的2.9倍，28d则达到3.7倍。见图1。

图1 OFQ在MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织中的表达

2.2 HE染色光镜观察肺动脉形态学变化

MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织切片，经过苏木素-伊红染色后与对照组比较，镜下可见：MCT大鼠肌性肺小动脉中膜的平滑肌明显增厚，管腔严重变窄。通过测量管腔横截面积与血管腔总面积发现，MCT组管腔明显狭窄。MCT诱导肺动脉高压大鼠肺小动脉存在血管内膜增生和血管重构现象。见图2A,图2B。

图2 肺组织HE染色光镜观察结果(×400)

2.3 OFQ在MCT诱导PAH大鼠肺动脉中IHC染色结果

OFQ在正常大鼠肺动脉中有少量表达，见图3A，在经过MCT诱导肺动脉高压后，肺小动脉增生明显，此时OFQ表达明显增加，主要定位于肺动脉的平滑肌细胞和细胞外基质，见图3B。

图3 OFQ在MCT诱导PAH大鼠肺动脉中IHC染色结果(×400)

2.4 OFQ在MCT诱导PAH大鼠血浆中检测浓度的变化

应用ELISA检测PHA大鼠7、14、21、28d血浆中OFQ浓度变化情况，显示随着时间的延长，OFQ的血浆浓度呈现逐渐升高趋势，此项变化趋势与肺组织中mRNA表达相一致。见表1。

表1 OFQ在MCT诱导PAH大鼠血浆中检测浓度变化

与Control组同一时间比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

孤儿肽( orphanin FQ, OFQ)又称为孤啡肽或者痛敏肽(nociceptin)，是一类由17个氨基酸组成的肽类物质，最初在神经系统中分离出来，实验证明OFQ能与阿片样受体( opioid-like receptor 1 OLR1 )特异结合，体内为 OLR1的内源性配体。早期的研究发现OFQ与神经系统的痛觉及记忆、情绪活动密切相关，在给予体外注射OFQ时发现OFQ能明显增加实验动物的尿量，同时减少尿中钠离子的排泄[5]。OFQ 除了在中枢神经系统有着广泛的分布，实验证实脑内主要以下丘脑及边缘系统的含量为最。OFQ的脑外组织分布主要在卵巢、脾脏、血液白细胞中，在心血管系统也有一定的分布，比如培养的血管平滑肌细胞、心房内皮细胞等[6,7]。近年来有报导，在冠状动脉粥样硬化疾病和心力衰竭等心血管疾病中OFQ有明显表达，参与心血管系统的病理生理调控。目前关于OFQ与肺动脉高压的相关性尚无研究报道，本实验基于此应用MCT诱导大鼠肺动脉高压模型，并对OFQ在肺动脉高压大鼠肺组织分布及肺动脉血管中表达情况进行初步研究。

肺动脉高压是临床上肺动脉压力持续进行性增加的一组症候群，尽管不同类型的PAH发病机制各异，但是最终病理上表现为肺小动脉的重构，血管平滑肌细胞增生，管腔狭窄。MCT诱导PAH大鼠模型在发病机制研究中比较常用，容易操作，模型构建成功率高。MCT在大鼠体内经过单氧化酶转化后，产生野百合碱吡咯，对肺动脉血管损伤，引起炎症反应、细胞的凋亡坏死，血管增生与重构，肺小动脉增生狭窄，肺动脉压力增高[8]。本实验MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织HE染色，显示肺高压组与正常组比较，肺小动脉内皮细胞肿胀，变性坏死脱落，血管中膜平滑肌增生，管壁增生增厚，血管腔内径变小。说明MCT诱导大鼠PAH模型构建成功，为后续的研究打下了基础。

研究证实OFQ在心血管系统血压调节活动中发挥着重要的作用，动物实验证实，在急性心肌缺血后小肠表达OFQ明显增加，并且与心肌的损害程度呈现正相关，实验表明在静脉注射OFQ时可以明显增加实验大鼠的尿量，并且能够降低尿钠的排除，OFQ的全身性降压作用是通过NO的舒张血管作用实现的[9]。实验说明OFQ在循环系统中表达并且发挥着调控血压的机制，但是在肺动脉高压的调控机制中是否也存在OFQ的表达，尚无报道。本实验肺动脉高压大鼠血浆OFQ的检测表明，OFQ在肺动脉大鼠血浆中OFQ含量与肺动脉高压进展程度呈现密切相关，随着MCT注射时间增加，其OFQ表达量也明显增加。在随后的PAH大鼠肺组织中OFQmRNA检测也证实了上述结果。

本研究免疫组化结果显示，OFQ在MCT诱导肺动脉高压大鼠的肺小动脉血管壁中表达增加，定位于发生重构的肺小动脉平滑肌细胞及细胞外基质呈现OFQ阳性反应。基于OFQ在对高血压调节机制的研究，我们推测OFQ参与肺动脉高压发病可能是通过促进肺小动脉的血管壁平滑肌细胞增殖来参与血管壁的重构，并且OFQ的表达增加又可能会起到延缓肺高压的作用，具体的确切机制还有待于进一步的实验研究。

本实验研究证明了在MCT诱导肺动脉高压大鼠血浆中及肺组织中均有OFQ的明显表达，随着时间的增长极肺动脉高压程度OFQ具有明显变化趋势，它可能参与了MCT诱导PAH大鼠的肺血管重构过程和肺动脉压力调节过程。

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The investigation of orphanin FQ in pulmonary arterial hypertension rats

ZHANGHong-liang1,JIAA-na2,LIUChun-hui1,WANGHui1,FANLei1,ZHAOZhi-min1，HEZhao-fa1

(1. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;2. Emergency Medical Centre in Jiamusi, Jiamusi 154002,China)

Objective: To investigate the expression pattern of orphanin FQ in pulmonary artery and serum of rats with pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods: Twenty rats were randomly divided into PAH group(n=15), which were intraperitoneally injected 60 mg/kg MCT and equal volume normal saline for control group (n=5). Reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to investigate the expression level of OFQ mRNA and protein. The immunohisto chemical method was performed to confirm the localization of OFQ in pulmonary artery of PAH. Results: The expression of OFQ mRNA and protein increased significantly in MCT group, and the positive immunohisto reactive OFQ was located on endothelium as well as smooth cells. Conclusion: OFQ was increased significantly in MCT induced PAH rat. It may be as a biomarker to estimate the severity of PAH, and take part in the remodeling process of the pulmonary vascular.

pulmonary arterial hypertension; orphanin FQ; rat; monocrotaline

1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201364；2.黑龙江省卫生厅项目，编号：2011-355。

张洪亮(1973～)男，黑龙江呼兰人，博士，副主任医师。

贺兆发(1962～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:21652994@qq.com。

R543.2

A

1008-0104(2016)06-0019-03

2016-07-13)