Vinculin和GFAP在大鼠肝纤维化中纤维母细胞的表达

张 辉,刘东璞,李 尧，王景霞，王淑英

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)



Vinculin和GFAP在大鼠肝纤维化中纤维母细胞的表达

张 辉,刘东璞,李 尧，王景霞，王淑英

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

目的:肝脏内有两种纤维母细胞,一种称之为肝星形细胞(hepatic stellate cell HSC),另一种是位于门脉周围的纤维母细胞。对这两种细胞在形成肝纤维化(hepatic fibrosis HF)后的细胞形态采用免疫组化方法进行组织学鉴别。方法: Wistar大鼠48只，雄性，体质量(160～210)g。随机选取24只,分为4组，每组6只，使用30% CCl4/mineral oil(1mL/kg)行腹腔内注射,并且分别于注射1d，2d，3d，4d后麻醉处死，取新鲜肝脏。其余24只,同样随机分为4组，每组6只 ,分别行胆总管结扎术1d,2d,4d,7d后麻醉处死，取新鲜肝脏。用SABC法来进行检测，一抗分别为Vinculin及GFAP。结果:CCl4腹腔注射后2d中央静脉周围的HSCs在Vinculin和GFAP染色中呈相同的强阳性表达; BDL处置4d后门脉区纤维母细胞在Vinculin染色中显示阳性结果,而在GFAP染色中呈现阴性结果。结论: Vinculin在HSCs和门脉区域的纤维母细胞阳性表达结果相同, GFAP可对有活性的HSCs和门脉区域的纤维母细胞进行检测鉴别。

肝星形细胞;肝纤维化;CCl4;BDL; Vinculin;GFAP

肝纤维化是继发于肝脏各种慢性损伤之后进行组织修复过程中的创伤愈合反应,而且它也是形成肝硬化所必经的病理过程。经研究显示,HSCs的激活与增生在肝纤维化的发生发展过程中起到了极其重要的作用[1]。并且经研究表明,HSCs在肝纤维化过程中属于关键介导环节。用四氯化碳诱导的方法来制作Wistar大鼠急性肝损害模型,能够导致并观察到细胞外基质的形态变化[2]。而且根据相关报道显示，用胆总管结扎术诱导的方法来制作Wistar大鼠急性肝损害模型,使门脉周围的纤维母细胞转化为肌纤维母细胞[3]。在对这两种细胞群进行比较分析发现, HSC的细胞质内的脂滴内含有维生素A,而在门脉周围的纤维母细胞内却没有观察到,因此在形态学上可以利用此特点对二者进行分析鉴别,但是在形成肝纤维化后，从形态学角度上已经不能区分这两类细胞群。本研究首先用两种方法制作大鼠急性肝损害模型,而后采用免疫组化方法对HSC和门脉周围的肌纤维母细胞形态进行检测和观察。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

Wistar雄性大鼠,体质量(160～210)g。由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验试剂

Vinculin单抗、GFAP单抗、SABC试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肝纤维化动物模型的制作

Wistar大鼠48只，雄性，体质量(160～210)g。随机选取24只,分为4组，每组6只，使用30% CCl4/mineral oil(1mL/kg)行腹腔内注射,并且分别于注射1d，2d，3d，4d后麻醉处死，取新鲜肝脏。其余24只,同样随机分为4组，每组6只 ,分别行胆总管结扎术1d,2d,4d,7d后麻醉处死，取新鲜肝脏。

1.2.2 肝组织病理学观察及免疫组化染色

摘除的肝脏进行常规石蜡包埋,4μm连续切片,常规HE染色后进行病理学观察肝纤维化程度。而后,运用免疫组织化学方法进行染色,所用一抗为Vinculin和GFAP。其染色结果由两名经验丰富的病理学专家观察并评估各组染色结果。

2 结果

2.1 GFAP免疫组化结果

在CCl4注射后所形成的大鼠急性肝损害模型中，注射2d后，对中心静脉周围的HSC进行观察，发现其呈现GFAP 强阳性染色(图1)。在对BDL方法所形成的大鼠肝纤维化模型的观察中，在对肝实质周边以及位于胆小管增生区域的HSCs进行观察发现， GFAP表达呈现弱阳性，而在对门脉区域内的纤维母细胞进行观察，发现其 GFAP呈现 阴性表达(图2)。

图1 GFAP在CCl4注射2d后的表达(×400)

图2 GFAP在BDL处置2d后的表达(×400)

图3 Vinculin在CCl4注射1d后的表达(×400)

图5 Vinculin在CCl4注射3d后的表达(×400)

图6 Vinculin在BDL处置2d后的表达(×400)

图7 Vinculin在BDL处置4d后的表达(×400)

2.2 Vinculin免疫组化结果

在CCl4注射后所形成的大鼠急性肝损害模型中，注射一天后，发现HSCs的表达呈现弱阳性(图3)；而注射2d后，对中央静脉附近区域的HSC进行观察，发现其呈现Vinculin强阳性表达(图4)；而在

注射3d后，对肝实质内的HSCs进行观察，发现其Vinculin表达呈现弱阳性(图5)。而在对BDL方法所形成的大鼠肝纤维化模型的观察中，并且在BDL 2d(图6)及4d(图7)后，对门脉区域内已活化的纤维母细胞进行观察，发现其呈现Vinculin阳性表达。

3 讨论

肝纤维化是由多方因素协同作用所导致的慢性肝损害病理改变，其主要表现为肝内细胞外基质成分的沉积量有所失衡[4]，而且可以对肝的正常功能有所损害，在各种临床慢性肝病发展为肝硬化的过程中，肝纤维化属于其所必经的阶段。本研究利用CCl4腹腔注射及BDL两种实验方法制作急性大鼠肝损害模型，并制备病理切片标本，使用免疫组化方法对Vinculin和GFAP在大鼠肝纤维化中纤维母细胞的表达进行检测。

经病理组织学切片观察显示，在CCl4肝纤维化模型组中，腹腔注射2d后，对中心静脉周围的HSCs进行观察，发现其呈现GFAP 强阳性染色；而对中央静脉附近区域的HSCs进行观察，发现Vinculin同样呈现强阳性表达。而在BDL大鼠肝纤维化模型中，在行BDL术4d 后，对门脉区域内的纤维母细胞进行观察，未发现GFAP有阳性细胞表达，呈现GFAP阴性。在对门脉纤维母细胞的观察中发现，并且对门脉以及增生的胆小管上皮细胞间隙中进行观察，发现门脉纤维母细胞可转化为MF。同时对门脉区域和肝实质细胞进行观察，在其间发现有已经活化的HSCs，发现其呈现Vinculin阳性表达，从此可以证明Vinculin抗体可以成为门脉区域纤维母细胞被活化的一种标记。

CCl4肝纤维化模型以及BDL肝纤维化模型，这两种实验方法虽然有所不同，但在处置并形成肝纤维化后，对HSCs和门脉区域纤维母细胞进行免疫组化染色并进行比较观察，发现Vinculin染色均呈现阳性表达，而GFAP染色表达却有所差别。由此可知，对成功的肝纤维化模型制作常规病理石蜡切片标本，在对有活性的HSCs和门脉纤维母细胞之间进行鉴别分析，GFAP抗体可以作为检测这两种纤维母细胞的一个指标。

[1]Fowell AJ, Collins JE, Duncombe DR, et al. Silencing tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs) with short interfering RNA reveals a role for TIMP-1 in hepatic stellate cell proliferation[J].Biochem biophys Res commun, 2011,407(2):277-282

[2]Friedman SL.Seminars in medicine of the Beth Hospital,Boston.The cellular basis of the hepatic fibrosis,mechanisms and treatment strategies[J].N Engl J Med,1993,328:1828-1835

[3]Desmouliere A,Darby I,Costa AMA,et al.Extracellular matrix deposition, lysyl oxidation expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat[J].Lab Invest,1997,76:765-778

[4]Zhao J,Zhang Z,Luan Y, et al. Pathological functions of interleukin-22 in chronic liver inflammation and fibrosis with hepatitis B virus infection by promoting T helper 17 cell recruitment [J]. Hepatology, 2014,59(4):1331-1342

1.黑龙江省卫生厅科研课题,编号:2011-428；2.佳木斯大学指导项目，编号：S2009-074。

张辉(1976～)男,黑龙江佳木斯人,硕士,副教授。

刘东璞(1969～)男，黑龙江佳木斯人，硕士,副教授,硕士研究生导师。E-mail:liudongpu1220@163.com。

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1008-0104(2016)06-0022-02

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