响应面优化超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的工艺研究

2016-12-27王华芳

三门峡职业技术学院学报 2016年1期

关键词：叶总杜仲芦丁

◎王华芳

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡4 7 2 0 0 0）

响应面优化超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的工艺研究

◎王华芳

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡4 7 2 0 0 0）

利用响应面分析法（RSA）对杜仲叶总黄酮提取工艺进行优化，通过了三因素三水平17组实验，考察了萃取温度、压强和时间对黄酮提取含量的影响。通过二次项回归方程分析，预测出最佳萃取工艺条件，即温度51℃，压强31.15MPa，时间90min，最高总黄酮含量为45.86mg/g。在最佳工艺条件下进行验证试验，所得总黄酮的含量为45.82mg/g，与预测结果吻合。

响应面分析；超临界CO2；总黄酮

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是一种名贵的中药材，蕴含有丰富的天然活性物质，如木脂素类、多糖、有机酸、黄酮类化合物等，其中黄酮类化合物是杜仲药效的主要活性成分之一，具有扩张冠状血管、促进血液循环、抗炎、抗病毒、抗癌、保肝利水、美容美发及祛斑等功效[1-4]，被广泛用于药品、食品及保健品中。邓素兰[5]等对杜仲根、茎、叶等不同部位中黄酮含量进行了测定，发现其各部位均含有总黄酮。相较于杜仲根茎，杜仲叶资源异常丰富，研究开发杜仲叶次生代谢物总黄酮提取，可实现杜仲资源的最大效益化。

超临界流体萃取技术是上世纪80年代引入我国的一种新型萃取技术，主要是利用高于临界压力和临界温度条件下的流体作为萃取剂，从目标物物种将有效成分萃取出来，具有提取率高、中药有效成分不被破坏、操作温度低，无有机溶剂残留、工艺简单等优点[6]。目前超临界CO2萃取技术已经被应用于中草药有效成分提取中，但是其在杜仲叶总黄酮提取工艺上的研究相对较少。

响应面优化法（RSM）是一种实验寻优方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题，通过对模型过程的回归拟合等求出并预测实验最优条件，由于其考虑了实验随机误差，计算简便，在实验寻优过程中可以连续地对实验的各水平进行分析，因此被广泛用于实验设计中。

本研究利用超临界CO2流体萃取技术，以总黄酮提取含量为响应值，通过响应面法得到回归方程，优化并验证杜仲叶中总黄酮提取最佳工艺，为今后杜仲叶药用资源的开发和利用提供理论参考。

1 实验部分

1.1 实验材料和试剂

杜仲叶采于河南省灵宝市，洗净、烘干、粉碎过40目筛后备用；芦丁标准品，中国药品生物制品鉴定所；无水乙醇、甲醇、醋酸、醋酸钠、二氯氧锆等均为分析纯；蒸馏水。

1.2 主要仪器

FA604A电子天平上海精天电子仪器有限公司；722型紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；超临界CO2萃取仪HA120-50-01型超临界萃取装置；中兴高速万能粉碎机北京中兴伟业仪器有限公司；电热恒温干燥箱上海沪升实验仪器厂；

1.3 实验方法

1.3.1 杜仲叶总黄酮的萃取

准确称取粉碎后的杜仲叶原料5.0000g放入萃取釜，夹带剂（甲醇）流量设置为0.5L/min，设定温度、压力和萃取时间，通入流量为2L/min的CO2进行萃取，萃取结束后收集提取液，过滤，待测定其吸光度值，并计算总黄酮浓度。

1.3.2 芦丁标准曲线绘制[7]

0.05000 mg/mL芦丁标夜的配制：精密称取25.00mg芦丁标准品，置于500ml容量瓶中，用甲醇定容，得0.05000mg/mL芦丁标准溶液。

pH=4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液：准确称取醋酸钠16.4000g,然后加冰醋酸20.00mL,加入蒸馏水搅拌溶解后定容至100mL容量瓶中。

标准曲线绘制：取10.00mL比色管6支，分别加入芦丁标液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL,再依次加入1.00mL醋酸-醋酸钠溶液，2.00mL2%二氯氧锆甲醇溶液，最后以甲醇定容，混匀。以试剂空白为对照参比溶液，待静置70min后分别测定其在440nm处的吸光度值。得到芦丁溶液质量浓度ρ（μg/ mL）与吸光度值A的回归方程，即A=aρ+b。

1.3.3 杜仲叶总黄酮提取量的测定

将杜仲叶提取液过滤后定容至100mL,准确吸取1.00mL样品置于10.00mL比色管中，依次加入1.00mL醋酸-醋酸钠溶液，2.00mL2%二氯氧锆甲醇溶液，最后以甲醇定容、混匀后测定其在440nm处的吸光度值，并代入标准曲线回归方程计算总黄酮的含量。

1.3.4 试验设计及分析

在单因素实验的基础上,根据Box-behnken实验设计原理运用Design Expert7.0设计响应面实验，分别以萃取温度、萃取压力和萃取时间这三个因素三水平共计17个实验点进行组合实验设计，以提取总黄酮的含量为判别指标确定最佳工工艺条件。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线绘制

按照1.3.2方法配制系列不同浓度的芦丁溶液，测量其吸光度值，同时以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，建立芦丁标准曲线，见图1，拟合线性回归方程为：A=0.00346ρ-0.0053，R2=0.9990，线性关系良好。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 萃取温度对黄酮提取效果的影响

准确称取5.00g杜仲叶粉末5份，设置夹带剂（甲醇）流量为0.5L/min，CO2流量为2L/min，设定压力30MPa,萃取时间90min，按照1.3.2中方法分别测定温度在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下的吸光度值，考察温度对萃取总黄酮的影响。

由图2可知，当压强和萃取时间固定后，随着温度的升高，总黄酮含量先升高后降低，并且在55℃下达到最高值，这可能是随着温度的升高，黄酮溶解度增加，之后由于温度过高，导致CO2流体密度降低所致[8]，因此选择55℃下萃取是比较合适的。

2.2.2 萃取压力对黄酮提取效果的影响

准确称取5.00g杜仲叶粉末5份，将甲醇夹带剂流量设置为0.5L/min，CO2流量为2L/min，设定温度55℃,萃取时间90min，按照1.3.2中方法分别测定20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa压力下提取液的吸光度值，考察压力对总黄酮的萃取效果，结果见图3。

由图3可以看出，随着压强由20MPa逐步上升到30MPa的过程中，黄酮提取含量呈现上升的趋势，超过30MPa后，呈下降趋势，下降幅度小于增长幅度。可能是由于压力增大，CO2流体与溶质之间的渗透增大，有利于萃取。当压强过高时，由于高压下CO2的可压缩性小，密度降低，溶解力降低[8]。另外，从设备安全性角度考虑，压强也不能太高。因此，压强取30MPa比较合适。

2.2.3 萃取时间对提取效果的影响

准确称取5.00g杜仲叶粉末5份，将甲醇夹带剂流量设置为0.5L/min，CO2流量为2L/min，设定温度55℃,压力30MPa，按照1.3.2中方法分别测定不同萃取时间30min、60min、90min、120min、150min下提取液的吸光度值，通过计算杜仲叶总黄酮的含量，进一步考察萃取时间对提取杜仲叶总黄酮含量的影响。

由图4可知，随着萃取时间的延长，杜仲叶中黄酮含量显著上升，主要是这主要是时间延长，增加了溶剂溶质接触的时间，有利于萃取完全。但是当萃取时间超过90min后增幅减缓，考虑原因是随着时间的延长，原料中杂质相对含量在增加，而有效溶质的量则是在减少，动力消耗在增加，操作费用增加，同时也降低了设备的生产强度[9]。因此，从提高效率和节约资源的角度，选择90min比较合适。

图1 芦丁溶液标准曲线图

图2 温度对提取杜仲叶总黄酮含量的影响

图3 萃取压力对提取杜仲叶总黄酮含量的影响

图4 萃取时间对提取杜仲叶总黄酮含量的影响

表1 响应面实验因素水平表

表2 响应面设计方案及结果

表3 响应面二次模型的方差分析表

2.3 响应面分析与优化实验结果

2.3.1 响应面实验设计方案

综合单因素实验结果，依据Design Expert7.0软件，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，采用响应面法在三因素三水平上对实验进行优化，实验因子和水平见表1。

根据表1设定的因素和水平，按表2实施17次试验，得到各个实验条件下的黄酮提取含量。以A（萃取温度）、B(萃取压强)和C（提取时间）为自变量，总黄酮提取含量（Y）为响应值，建立杜仲叶总黄酮提取含量的回归方程为:

注：模型的R2=0.9988，R2Adj=0.9972,R2pred= 0.9885 Adeq Precision=66.42

由表3可以看出该模型极显著（p＜0.0001），在统计学上具有意义，同时，信噪比值（66.42）很高，失拟项值0.3224也大于0.05，充分表明该模型与试验的拟合度良好，可用于预测。另外，模型的R2= 0.9988，R2Adj=0.9972，说明响应值的变化有99.88%来源于所选自变量，R2Adj=0.9972,R2pred=0.9885，两者相近，说明回归方程线性关系良好，这进一步说明回归方程可以替代真实点对实验结果进行分析和预测。

响应面3D图和等高线图能够通过响应值在图像上的直观表现反应各因素及各因素交互作用对总黄酮提取效果的影响。运用Design Expert7.0软件，将因素两两比较分析并绘制响应面3D曲线图，结果见图5-图7.

图5 温度-压强两因素交叉响应面曲线图

从图5可以看出，压强对总黄酮提取效果的影响较温度显著，曲面较陡，随着温度的升高，提取效果呈现先上升后下降的趋势，下降趋势明显与升高趋势。图5等高线图成近似圆形，说明压强和温度之间的交互作用不明显。从图6可知，相较时间，温度对总黄酮提取效果的影响较显著，曲面陡峭，而时间曲线则比较平缓。等高线呈椭圆形，说明两者的交互作用较显著。同理，分析图7可知，压强对总黄酮提取效果影响较显著，时间则不显著。等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。综合三张图可知，各因素对总黄酮提取效果的影响大小依次为：压强＞温度＞时间。

2.3.3 验证结果

经过响应面回归方程分析，得到该模型下总黄酮的最佳提取工艺条件为：温度51.05℃，压强31.15MPa，时间90min，在此条件下，杜仲叶总黄酮提取含量的预测值为45.86mg/g.为了检验响应面优化预测实验结果的可靠性，在上述条件下进行三次平行试验，得到杜仲叶总黄酮平均提取含量为45.82mg/g，相对误差约为0.09%，且是所有试验中最高提取结果，该值与响应面预测值基本吻合，也进一步验证了响应面二次回归方程应用于杜仲叶总黄酮提取实验寻优体系的可靠性。

图6 温度-时间两因素交叉响应面曲线图

图7 压强-时间两因素交叉响应面曲线图

3 结论

通过响应面优化实验建立了杜仲叶总黄酮提取二次回归方程模型，回归方程为:Y=44.81-1.79A+ 1.31B+1.04C-1.13A*B+0.79A*C-0.32B*C-3.04A2-2.65B2-0.21C2并预测了最佳工艺条件，即：温度51℃，压强31.15MPa，时间90min，最高总黄酮含量为45.86mg/g。同时，通过方差分析可知，二次曲线回归模型的p＜0.0001，为极显著水平，在统计学上具有意义，且信噪比值（66.42）很高，失拟项值0.3224也大于0.05，这些都充分说明实验所得二次回归模型与试验的拟合度良好，可用于预测。在最佳工艺条件下进行验证试验，通过方差分析，得到总黄酮的含量为45.82mg/g，与预测结果吻合。

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（责任编辑卞建宁）

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