食管鳞癌组织中Pokemon、MDM2、p53蛋白表达变化及意义

姜海斌，李超，赵云霞，韩双双，宋翔，刘德华，于卫芳

(1承德市中心医院，河北承德067000；2河北医科大学第一医院)



食管鳞癌组织中Pokemon、MDM2、p53蛋白表达变化及意义

姜海斌1，李超2，赵云霞2，韩双双2，宋翔2，刘德华2，于卫芳2

(1承德市中心医院，河北承德067000；2河北医科大学第一医院)

目的 观察食管鳞状细胞癌(鳞癌)组织中POK红系髓性致癌因子(Pokemon)、小鼠双微体基因(MDM2)、转录调节因子p53蛋白的表达变化，并探讨其意义。方法 取62例食管鳞癌患者术中切除食管鳞癌组织62例份为观察组，癌旁正常食管黏膜组织(均距离癌组织边缘5 cm以上)35例份为对照组。采用免疫组化方法检测两组肿瘤组织Pokemon、MDM2、p53蛋白，分析其与食管鳞癌临床病理参数的关系。结果 观察组、对照组Pokemon蛋白的阳性表达率分别为67.74%(42/62)、42.86%(15/35)，两组相比，P<0.05；MDM2蛋白的阳性表达率分别为54.84%(34/62、28.57%(10/35)，两组相比，P<0.05；p53蛋白阳性表达率分别为72.58%(45/62)、17.14%(6/35)，两组相比，P<0.01。Pokemon、MDM2蛋白表达与食管鳞癌分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P均<0.05)，而与性别、年龄及肿瘤是否侵及纤维膜无关(P均>0.05)；p53蛋白表达与食管鳞癌分化程度、肿瘤是否侵及纤维膜、淋巴结转移、TNM分期有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄无关(P均>0.05)。Spearman相关分析显示，食管鳞癌组织中Pokemon与MDM2蛋白表达呈正相关(r=0.599,P<0.01)；Pokemon与p53蛋白表达呈正相关(r=0.501,P<0.01)；MDM2与p53蛋白表达呈正相关(r=0.359,P<0.01)。结论 食管鳞癌患者癌组织Pokemon、MDM2、p53蛋白高表达。Pokemon、MDM2、p53蛋白的表达与食管鳞癌分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关。

食管鳞状细胞癌；红系髓性致癌因子；小鼠双微体基因；转录调节因子p53

食管癌是中国居民的常见恶性肿瘤，多年来其发病率和死亡率居高不下，严重威胁人民生命健康[1]。中国居民食管癌的病理组织学类型主要为鳞状细胞癌(鳞癌)，占90%以上。目前，应用单一肿瘤标志物对于食管鳞癌的早期诊断价值有限。POK红系髓性致癌因子Pokemon是由ZBTB7基因编码的原癌基因，能通过分子网络调控一些癌基因或抑癌基因的表达[2,3]。MDM2为小鼠双微体基因，可编码一种锌指蛋白，与p53蛋白结合后发挥抑制p53介导的转录活性和阻止p53诱导的凋亡作用，发挥癌基因作用[4]。p53基因是人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，超过50%的人类肿瘤组织中存在p53基因表达异常，其可通过调控DNA修复、细胞周期停滞和诱导细胞凋亡来抑制恶性肿瘤生长[5,6]。本研究观察了食管鳞癌组织与正常食管黏膜组织Pokemon、MDM2、p53蛋白的表达情况及与临床病理特征之间的关系，探讨三者在食管鳞癌发病过程中的作用及临床意义，旨在为食管鳞癌的早期诊断和预后判断提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1月～2014年12月间在河北医科大学第一医院行择期手术治疗的62例食管鳞癌患者，其中男39例、女23例，年龄48～75(63.1±5.7)岁。高分化10例，中分化28例，低分化24例；肿瘤侵及纤维膜36例，未侵及纤维膜26例；有淋巴结转移24例，无淋巴结转移38例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期42例、Ⅲ+Ⅳ期20例。术前均未进行放疗、化疗和其他抗肿瘤相关治疗，临床病理资料完整。纳入标准：术前均未进行放疗、化疗和其他抗肿瘤相关治疗，临床病理资料完整。排除标准：食管腺癌患者，术前进行放疗、化疗和其他抗肿瘤相关治疗，临床病理资料不完整。62例患者均行手术切除肿瘤，取术中切除食管鳞癌组织62例份为观察组，其中35例患者的癌旁正常食管黏膜组织(均距离癌组织边缘5 cm以上)35例份为对照组。全部诊断均由两位高年资病理医师验证。本研究获得河北医科大学第一医院伦理委员会批准。

1.2 两组肿瘤组织中Pokemon、MDM2、p53蛋白检测 所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色。采用免疫组化SP法染色，柠檬酸缓冲液煮沸修复，严格按照免疫组化试剂盒说明书步骤进行，DAB显色，苏木素复染，以已知阳性组织切片作阳性对照，以PBS液代替一抗作阴性对照，Pokemon抗体滴度为1∶40。浓缩兔抗人Pokemon多克隆抗体购自上海艾博抗贸易有限公司，小鼠抗人MDM2单克隆抗体工作液、兔抗人p53单克隆抗体工作液、免疫组化试剂盒、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用双盲法显微镜下观察结果，每张切片随机取5个400倍视野。Pokemon蛋白为细胞质和细胞核染色，MDM2蛋白和p53蛋白为细胞核染色，淡黄色为阳性，不着色为阴性。阳性判定以阳性细胞百分比及细胞着色程度综合判定[6]。按阳性细胞百分比计分：阳性细胞百分比≤5%计0分、6%～25%计1分、阳性细胞百分比26%～50%计2分、阳性细胞百分比≥51%计3分；按细胞着色程度计分：细胞不着色计0分、着色为淡黄色计1分、着色为棕黄色计2分、着色为棕褐色计3分。上述两分之和，≤3分判为阴性、>3分判为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组、对照组Pokemon蛋白阳性表达率分别为67.74%(42/62)、42.86%(15/35)，两组比较，χ2=5.717，P<0.05；MDM2蛋阳性表达率分别为54.84%(34/62)、28.57%(10/35)，两组比较，χ2=6.228，P<0.05；p53蛋白阳性表达率分别为72.58%(45/62)、17.14%(6/35)，两组相比，χ2=27.575，P<0.01。

Pokemon、MDM2、p53蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的关系见表1。Pokemon蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(χ2值分别为4.356、6.995、5.411，P均<0.05)，而与患者的性别、年龄及肿瘤是否侵及纤维膜无关(χ2值分别为0.056、0.520、0.789，P均>0.05)；MDM2蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移和TNM分期明显相关(χ2值分别为6.427、4.045、4.406，P均<0.05)，而与患者的性别、年龄及肿瘤是否侵及纤维膜无相关性(χ2值分别为0.537、0.511、0.018，P均>0.05)；p53蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、是否侵及纤维膜、淋巴结转移、TNM分期有关(χ2值分别为4.380、4.987、4.380、5.756，P均<0.05)，而与患者的性别、年龄无关(χ2值分别为0.996、0.063，P均>0.05)。

表1 Pokemon、MDM2、p53蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的关系(例)

Spearman等级相关分析显示，食管鳞癌组织中Pokemon与MDM2蛋白表达呈正相关(r=0.599,P<0.01)；Pokemon与p53蛋白表达呈正相关(r=0.501,P<0.01)；MDM2与p53蛋白表达呈正相关(r=0.359,P<0.01)。

3 讨论

研究表明Pokemon→ARF→MDM2→ p53通路在肿瘤发生过程中发挥重要作用，即Pokemon蛋白可通过阻止细胞凋亡、促进细胞增殖和癌性转化，特异性地抑制肿瘤抑制蛋白ARF及其激动剂而发挥致癌作用[7]。文献报道，Pokemon蛋白在小细胞肺癌[8]、鼻咽癌[9]、大肠癌[10]、胃癌[11]等多种恶性肿瘤组织中的表达显著增高。目前，关于Pokemon蛋白与食管鳞癌发病关系的研究较少。本研究结果显示，食管鳞癌组织Pokemon蛋白表达显著高于食管正常黏膜，提示Pokemon蛋白在食管鳞癌发病过程中发挥作用，与马莉等[12]研究结果一致。Pokemon蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移、TNM分期明显相关，而与患者的性别、年龄及肿瘤是否侵及纤维膜无关，提示Pokemon蛋白在判断食管鳞癌的恶性程度、预后方面存在一定的临床价值。张健等[13]研究发现，Pokemon蛋白表达与食管鳞癌的淋巴结转移、TNM分期明显相关，与本研究结论相近；Pokemon蛋白表达与分化程度无关，与本研究结论相左，考虑可能与病例数量偏少及分组不同有关，需增加病例数量进一步研究。

MDM2基因为癌基因，转录的MDM2蛋白可与野生型p53蛋白酸性活化域直接结合，形成MDM2-p53复合物，能降低野生型p53转录活性，使其丧失抑癌功能，导致细胞增殖失控、促进肿瘤的发生[4]。本研究结果显示，MDM2蛋白在食管鳞癌组织的表达显著高于食管正常黏膜组织，提示MDM2蛋白在食管鳞癌发病过程中发挥作用。李灵敏等[14]研究发现，MDM2在正常食管黏膜、不典型增生食管黏膜、食管鳞癌组织中的表达呈明显上升趋势，与本组研究结果相近。MDM2蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移、TNM分期明显相关，而与患者的性别、年龄及是否侵及纤维膜无关，提示MDM2蛋白有潜力成为食管鳞癌早期诊断和评估预后的指标。李灵敏等[14]提出，MDM2蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移相关，与本研究结论一致。Chai等[15]在食管鳞癌患者血清中检测出MDM2蛋白，且高于正常患者组，提示其有望成为食管鳞癌肿瘤标志物。

p53是重要的抑癌基因。体内正常存在的野生型p53有抑制细胞癌变的作用，而突变型p53则可促进细胞癌变。本研究结果显示，食管鳞癌组织p53蛋白表达显著高于癌旁正常食管黏膜组织，提示突变型p53蛋白在食管鳞癌组织中占主导优势。p53蛋白表达与食管鳞癌分化程度、是否侵及纤维膜、淋巴结转移、TNM分期明显相关，与患者性别、年龄无明显相关性，提示突变型p53蛋白参与食管鳞癌浸润生长及转移，影响患者预后。沈鸿彬等[16]研究发现，食管鳞癌组织中突变型p53蛋白表达阳性率明显高于正常食管组织，突变型p53蛋白表达与食管鳞癌的分化程度、有无淋巴结转移、癌浸润深度相关，与本研究结果一致。罗永富[17]研究发现突变型p53阳性表达率越高，患者的5年生存率越低，预后越差，证实基因突变与食管癌预后相关。进一步提示突变型p53对于食管鳞癌的早期诊断与预后存在判断价值。

本研究结果显示，食管鳞癌组织中Pokemon、MDM2和p53蛋白表达互为正相关，进一步佐证了三者作为Pokemon→ARF→MDM2→ p53致癌通路上的重要环节，在食管鳞癌的发病过程中发挥作用。朱迎春等[18]研究结果显示人结肠癌细胞中Pokemon蛋白表达与p53蛋白表达呈负相关，与本研究结果不符，考虑在不同病理类型的恶性肿瘤中，Pokemon和p53蛋白发挥的作用可能并非通过上述单一通路进行调节，也可能存在其他通路的相互影响，或与本研究测定的p53主要为突变型有关。

综上所述，食管鳞癌组织中Pokemon、MDM2、p53蛋白高表达。三者在食管鳞癌的发生和转移过程中发挥重要作用，有可能成为食管鳞癌早期诊断和评估预后的指标。通过各种途径调控食管鳞癌组织中Pokemon、MDM2、p53蛋白表达水平可能是治疗食管鳞癌的新途径。

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河北省科技惠民计划课题(14277752D)；河北省医学科学研究重点课题计划(20160298)。

于卫芳(E-mail: ydyynjzx@126.com)

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R735

B

1002-266X(2016)39-0050-03

2016-04-13)