补肾解毒通络方剂灌胃自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓及脑组织中MMP-9蛋白表达观察

赵铎，王丹，郑春欢，郑绍周

(1河南中医学院第一附属医院，郑州450000；2河南中医学院)



补肾解毒通络方剂灌胃自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓及脑组织中MMP-9蛋白表达观察

赵铎1，王丹1，郑春欢2，郑绍周1

(1河南中医学院第一附属医院，郑州450000；2河南中医学院)

目的 观察补肾解毒通络方剂灌胃的自身免疫性脑脊髓炎大鼠 (EAE)脊髓及脑组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达变化。方法 80只大鼠随机分为高、中、低剂量组，EAE组和空白组各16只。高、中、低剂量组和EAE组构建急性EAE模型。高、中、低剂量组于造模第1天开始，分别予60、30、15g/kg补肾通络方剂灌胃，1 次/d,共7d。EAE组予生理盐水2mL/只灌胃，1 次/d，共7d。空白组不做任何处理。造模第15、21天记录各组大鼠神经功能评分，断头处死后分离脊髓、脑组织，采用免疫组化法检测各组大鼠脊髓、脑组织中的MMP-9蛋白。 结果 造模第15、21天，高、中、低剂量组、EAE组神经功能评分均高于空白组，P均<0.05。造模第15天，中、高剂量组与EAE组神经功能评分比较，P均<0.05。造模第21天，中剂量组与EAE组神经功能评分比较，P<0.05。造模第15、21天高、中、低剂量组、EAE组脊髓、脑组织MMP-9蛋白IOD均高于空白组，P均<0.05。造模第15、21天，低、中、高剂量组与EAE组脊髓、脑组织MMP-9蛋白IOD均比较，P均<0.05。 结论 补肾解毒通络方剂能下调大鼠模型脊髓、脑组织MMP-9的表达。

多发性硬化；实验性自身免疫性脑脊髓炎；补肾解毒通络方剂；基质金属蛋白酶

多发性硬化(MS)是一种病因不明的以中枢神经系统(CNS)脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病，其发病机制尚不明确，可能与遗传、生态环境、病原体感染以及自身免疫反应等多种因素有关。最新研究[1]认为MS是自身反应性T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一组锌依赖的金属蛋白内切酶家族中的重要一员,MMP-9惟一的内源性抑制剂是金属蛋白酶组织抑制剂1(tTIMP-1)，二者之间的平衡对维持细胞外基质(ECM)成分动态平衡至关重要。近年研究发现,MMP-9与MS的发病关系密切，是MS中神经炎症及血脑屏障破坏的主要参与者,在MS的发生和发展中具有重要意义。实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)[2]是目前研究MS常用的经典动物模型。近年研究[3]发现，补肾解毒通络方剂治疗MS效果较好，但其具体作用机制尚缺乏深入研究。2015年6～12月，我们观察了补肾解毒通络方剂灌胃的EAE大鼠模型脊髓、脑组织MMP-9表达变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 清洁级健康雌性成年Wistar大鼠80只，体质量180～220 g，由郑州大学动物实验中心提供，合格证号：0009367；豚鼠15只，体质量350～450 g，由郑州大学动物实验中心养殖场提供。补肾通络方剂组成：淫羊藿30 g、巴戟天20 g、菟丝子30 g、重楼30 g、六月雪浸膏(5 g/mL×6 mL,相当于生药30 g)、白花蛇舌草15 g、全蝎10 g、僵蚕15 g、黄芪30 g、泽泻30 g、川芎20 g、皂刺15 g、莪术25 g、甘草6 g。除六月雪外，余中药采用散装颗粒剂，每付颗粒剂加6 mL六月雪浸膏混合，温开水稀释，配置成浓度为6 g/mL的补肾通络方剂药液由河南中医学院第一附属医院制剂室提供，4 ℃保存备用。完全弗氏佐剂(CFA)(美国Sigma公司)、百日咳杆菌原液(北京生物制品研究所)、10%水合氯醛(河南中医学院第一附属医院)、TGL-16R冷冻高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)、Olympus CHC显微镜(日本Olympus株式会社)。

1.2 大鼠分组及补肾解毒通络方剂给药方法 80只大鼠随机分为高、中、低剂量组，EAE组和空白组，每组16只。高、中、低剂量组和EAE组参照文献[4～7]方法构建急性EAE模型。豚鼠腹腔注射10%水和氯醛麻醉后，在冰上迅速剖开背部皮肤、暴露脊柱，剪断枕骨大孔、第一尾椎，分离脊柱，纵向剪开椎管取出脊髓，去除脊膜，称重后放入匀浆器，加入等量冰生理盐水，将匀浆器放入冰水中研磨成50%的豚鼠脊髓匀浆(GPSCH)。取10 mL玻璃注射器2支，一支抽取GPSCH，另一支抽取等体积的CFA，取12号硅胶管约10 cm，紧密连接2支注射器，冰上反复抽打GPSCH 直至成为GPSCH抗原油包水乳剂。取少许油包水乳剂滴入水中，10 min未见消散即为GPSCH抗原油包水乳剂制备成功。取各组大鼠，两足均经足垫皮下注射0.1 mL GPSCH抗原油包水乳剂，右下肢足背部皮下注射百日咳杆菌原液0.1 mL，制作急性EAE模型。造模第1～2天出现四肢足垫红肿视为造模成功。空白组不做任何处理。高、中、低剂量组于造模第1天开始，分别予60、30、15 g/kg 补肾通络方剂灌胃，1 次/d, 共7 d。EAE组予生理盐水2 mL/只灌胃， 1 次/d, 共7 d。空白组不做任何处理。

1.3 各组大鼠神经功能观察 分别于造模第15、21天取各组大鼠，参照文献[8]方法观察各组大鼠神经功能，采用Kohn等[8]的5分法对各组大鼠神经功能进行评分:0分为大鼠未发病；1分为大鼠尾部张力下降或肢体轻度笨拙；2分为尾部张力消失、中度笨拙或姿势维持缺乏；3分为大鼠后肢无力或部分瘫痪；4分为后肢完全瘫痪或前肢无力；5分为大鼠四肢瘫痪或濒临死亡。

1.4 各组大鼠脊髓、脑组织MMP-9蛋白检测 分别于造模第15、21天取各组大鼠，每组8只，断头处死后分离脊髓、脑组织，常规脱水，石蜡包埋及制片，HE染色，采用免疫组化法检测各组大鼠脊髓、脑组织中的MMP-9蛋白。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。每只大鼠脑、脊髓组织切片随机选取6个高倍视野(400×)，采用IPP图像分析软件对各组标本进行定量分析，结果用积分光密度(IOD)表示。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。各组检测结果数值资料以表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

造模第15、21天各组大鼠神经功能评分见表1。造模第15、21天各组大鼠脊髓、脑组织中MMP-9蛋白IOD见表2。

表1 造模第15、21天各组大鼠神经功能评分比较(分，

表2 造模第15、21天各组大鼠脊髓、脑组织中MMP-9蛋白IOD比较

3 讨论

MS是一种免疫介导的中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘疾病，是以细胞免疫为主的自身免疫性疾病。炎性细胞尤其是T淋巴细胞向中枢神经系统的迁移和浸润是制作MS动物模型的关键因素。EAE是一种以特异性致敏的CD4+淋巴细胞介导的,以中枢神经系统脱髓鞘、血脑屏障破坏及脑脊髓实质和血管周围单核淋巴细胞浸润为特征的实验动物的自身免疫性疾病，是目前研究多MS的经典动物模型[2，3]。基质金属蛋白酶(MMPs)是锌依赖的金属蛋白内切酶家族，参与人体正常胚胎发育和组织重塑,在正常状态下其活性被抑制在较低水平。MMP-9为MMPs家族的一种,属于明胶酶。国内外多组实验研究[9]均观察到，EAE发病急性期脑脊髓实质内及血管旁有大量淋巴样炎性细胞浸润，免疫组化结果提示提示该阶段存在MMP-9高表达。MMPs几乎涉及MS发病过程中的所有病理损伤环节，过量的MMPs持续水解蛋白也是MS神经损伤的关键因素之一。MS患者血清MMP-9水平值显著升高[10]，MMP-9可降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，纤维连接蛋白及明胶等ECM,还可降解髓鞘碱性蛋白，其降解产物可进一步增强自身免疫反应，并造成抗原决定簇(表位)的扩散。MMP-9水平可以作为评估MS患者血脑屏障(BBB)的破坏及预测MRI发现活动性病灶的可信赖指标。有离体实验证明MMP-9能够通过降解血管内皮细胞中的基质蛋白进而增加微血管内皮的通透性，同时其降解的基质片断对炎症细胞有趋化作用，从而可以使T细胞等炎症细胞穿透BBB基底膜。MMP-9可以通过降解细胞外基质，进而促使炎性细胞在中枢神经系统内扩散。

MS属中医学“痿证”范畴，其次可归属于眩晕、青盲、骨繇、痹证等疾病，其原因责之先天不足、禀赋异常。先天不足、肾精亏虚则脑髓失养，内伤之病易伤及脑髓；禀赋异常、肺卫不固，则易受六淫与邪毒侵袭。本病多为外受湿热毒邪侵袭，肺卫气虚，不能抵御外邪，导致湿热毒邪伤及肌肤、直入经络、阻滞气血、导致痰瘀阻络；而肾精亏虚，脑髓失养，外感之毒邪迅速伤及脑髓，导致肢体痿软、视物模糊、四肢麻木等症状。MS的病位在脑髓，《灵枢·海论》曰：“脑为髓之海”。《素问·五脏生成》说：“诸髓者，皆属予脑”。肾为先天之本，藏精、主骨、生髓。因此MS病位肾。毒邪是多发性硬化发病及复发的主要病理因素[11]。毒邪除外来之湿、热、毒邪侵袭外，亦可见内生之湿、浊、痰、瘀。MS急性发作期(发病15 d之前)邪毒侵袭人体，上犯于脑，损伤脑髓，导致气血运行不畅，元神失养而肢痿不用；或湿热蕴藏，导致三焦气化不利，津聚成痰，痰热互结，筋脉失养[12]。其病机多为肾精亏虚、毒损脉络。肾虚是MS的发病基础；毒邪侵犯人体是发病的直接诱因[13]；毒损脑髓、络脉瘀滞是造成肢体痿废失用且迁延难愈的根本原因[14]。毒损督络、戕害肾阳及脑髓、败坏形体为本病的核心病机，肾精不足是其主要内因，内外湿热毒邪是其主要致病因素[15]。本病的病位在脑髓，其基本病机为脾肾亏虚、痰瘀阻络、浊毒内蕴；以脾肾亏虚为本，痰、瘀、湿、毒为标，本虚尤以肾虚为著。故提出补肾解毒通络法是预防性治疗多发性硬化急性期的基本治法[16]。因而在治疗上倡导益肾解毒、化浊通络之法。故在中医“肾藏精”、“肾生髓通于脑”经典脏象理论的指导下，从肾虚邪毒入手，以补肾解毒通络之法治疗多发性硬化。补肾解毒通络方系名老中医郑绍周教授的经验方，方中淫羊藿、巴戟天、菟丝子补益肾精，重楼、六月雪、白花蛇舌草清热解毒，全蝎祛风解毒、僵蚕疏风通络，黄芪补益中气，泽泻健脾顾护后天之本、川芎祛瘀通络，皂刺、莪术搜风通络，甘草调和诸药。诸药相辅相成，共奏补肾益精、解毒通络之功。本研究结果显示，造模第15、21天，高、中、低剂量组和EAE组神经功能评分均高于空白组。造模第15天，中、高剂量组神经功能评分低于EAE组。造模第21天中剂量组神经功能评分低于EAE组。造模第15、21天高、中、低剂量组和EAE组脊髓、脑组织MMP-9蛋白IOD均高于空白组。造模第15、21天低、中、高剂量组脊髓、脑组织MMP-9蛋白IOD均低于EAE组均。说明补肾解毒通络方剂可明显降低急性期、缓解期EAE大鼠脊髓、脑组织中MMP-9的表达。

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河南省科技厅科技攻关项目 (122102310458[2012]25号)；河南省重点中医学科(专科)学术带头人培养项目专项课题(2013ZY03005)；全国名老中医药专家郑绍周传承工作室(国中医药人教函[2012]149号)。

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2015-12-31)