缺血再灌注对大鼠心肌H9c2细胞活性、凋亡的影响及其机制

杨莹莹，孙晓鸥，谭文,2

(1 华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006；2 广东工业大学生物医药研究院)



缺血再灌注对大鼠心肌H9c2细胞活性、凋亡的影响及其机制

杨莹莹1，孙晓鸥1，谭文1,2

(1 华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006；2 广东工业大学生物医药研究院)

目的 观察缺血再灌注对大鼠H9c2心肌细胞活性、凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法 H9c2细胞分为A、B组，1×104/孔接种于96孔板，每组6个复孔。细胞贴壁生长24 h时B组吸弃原培养基,加入人工缺氧液100 μL，置于含94% N2、1% O2、5% CO2的三气培养箱中培养90 min；吸弃缺氧液，加入DMEM高糖培养基，置于正常培养箱中培养90 min备用。A组仅加入DMEM高糖培养基，置于正常培养箱中培养90 min备用。采用MTT法检测细胞活性，TUNEL法检测凋亡细胞，采用激光共聚焦显微镜观察并计算两组细胞活性氧簇(ROS)含量及线粒体膜电位(MMP)，采用Western blotting法检测心肌细胞热休克蛋白60(HSP60)、过氧化物氧化还原酶(Prx)、硫氧还原蛋白(Trx)、线粒体分裂蛋白(Fis1)。结果 A、B组心肌细胞活性分别为0.77±0.01、0.40±0.02，二者比较，P<0.05。A、B组心肌细胞凋亡率分别为2.24%±0.12%、41.78%±1.43%，二者比较，P<0.05。A组细胞ROS含量及MMP分别为0.58%±0.02%、1.12%±0.05%，B组分别为1.13%±0.05%、0.76%±0.01%，组间比较，P均<0.05。与B组相比，A组心肌细胞HSP60、Fis1蛋白表达升高，Prx2、Trx1蛋白表达降低，P均<0.05。结论 缺血再灌注后H9c2细胞出现细胞活性下降、细胞凋亡，其机制可能与缺血再灌注促进细胞HSP60、Fis1蛋白表达，抑制Prx2、Trx1蛋白表达有关。

缺血再灌注；H9c2心肌细胞；细胞活性；细胞凋亡；活性氧簇；线粒体膜电位；热休克蛋白60；过氧化物氧化还原酶；硫氧还原蛋白；线粒体分裂蛋白

心肌梗死是目前病死率、致残率最高的疾病之一[1]，早期进行溶栓或应用经皮冠状动脉介入治疗是其有效治疗方法。治疗过程中心肌组织恢复血流的同时可加重心肌组织不可逆损伤程度，这种现象被称为心肌缺血再灌注[2,3]。探讨心肌缺血再灌注时的损伤机制对心肌梗死的治疗有重要价值。活性氧簇(ROS)主要包括一些氧自由基及其衍生物，可导致细胞的急慢性损伤及凋亡[4]。热休克蛋白60(HSP60)是一种应激蛋白，其在心血管疾病的发生发展中起重要作用[5]。过氧化物氧化还原酶(Prx)及硫氧还原蛋白(Trx)是一类抗氧化蛋白。线粒体是细胞供能代谢中心，同时也是细胞内ROS的主要来源[6]。分裂蛋白(Fis1)是调控线粒体分裂的主要蛋白，线粒体膜电位(MMP)是常用的线粒体检测指标。本研究观察了缺血再灌注对H9c2心肌细胞活性、凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 H9c2心肌细胞系购自中科院上海细胞库，于含10% FBS、1%双抗的高糖培养基，5 % CO2、37 ℃恒温恒湿培养箱中培养。待细胞融合至80%～90%可进行传代，备用。按文献[7]方法配制人工缺氧液，成分如下：137 mmol/L NaCl、15.8 mmol/L的KCl、0.49 mmol/L的MgCl2、0.9 mmol/L的CaCl2、4.0 mmol/L的HEPES、10 mmol/L的2-脱氧葡萄糖(抑制糖酵解)、20 mmol/L的乳酸钠(模拟乳酸积累)、1 mmol/L的连二亚硫酸钠(氧清除剂)，pH 6.5(模拟酸中毒)。MTT购自美国Sigma公司；Jc-1、DCF-DA、DAPI购自美国Life technology公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司，HSP60、Trx1单克隆抗体购自美国CST公司，Prx2单克隆抗体购自美国Abcam公司，Fis1单克隆抗体、β-actin、HRP标记的二抗购自美国Santa Cruz公司， FITC标记的羊抗兔荧光二抗购自美国Jackson Immuno Research公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司，ECL化学发光底物购自美国Thermo公司，PVDF膜购自美国Millipore公司。双人超净工作台购自上海博迅实业有限公司，CO2培养箱购自美国NUAIRE公司，三气培养箱购自美国Thermo公司，激光共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司；多功能酶联检测仪购自美国PerkinElmer公司，蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 H9c2细胞分组及缺血再灌注方法 取对数生长期的H9c2细胞，分为A、B组，1×104/孔接种于96孔板，每组6个复孔。细胞贴壁生长24 h时B组吸弃原培养基，PBS冲洗3次，加入人工缺氧液100 μL，置于含94% N2、1% O2、5% CO2的三气培养箱中培养90 min；吸弃缺氧液，加入DMEM高糖培养基，置于正常培养箱中培养90 min备用。A组吸弃原培养基，加入DMEM高糖培养基，置于正常培养箱中培养90 min备用。倒置荧光显微镜下可见B组细胞出现明显的萎缩，细胞核突出，细胞边缘模糊，甚至死亡。

1.3 各组心肌细胞活性观察 采用MTT法。H9c2心肌细胞于96孔板中复灌完成后开始进行细胞活性的测定。5 mg/mL MTT储备液用DMEM稀释100倍后使其终浓度为0.05 mg/mL，吸出原复灌液，加入稀释好的MTT溶液100 μL/孔(注意避光)，于培养箱中继续培养4 h，使其充分反应。4 h后，终止培养并小心吸出各孔内的上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，避光条件下在摇床上低速振荡10 min使化合物充分溶解，然后用酶标仪测定吸光度值，测定条件设置为490 nm、37 ℃。以吸光度值代表细胞活性，每组设置6个重复样品孔，重复3次，取平均值。

1.4 各组细胞凋亡检测 采用TUNEL法。当细胞融合度达到90%左右，以5×104/孔接种于24孔板，每组3个复孔。缺血复灌完成后，吸掉培养基，PBS冲洗3次，每孔300 μL，4%多聚甲醛溶液室温固定20 min；PBS冲洗3次，每孔加入1% Triton X-100溶液200 μL，室温促渗透5 min；PBS冲洗3次，加入50 μL TdT酶反应液，置于37 ℃恒温箱中避光反应60 min；PBS冲洗3次，50 μL Streptavidin-Fluorescein反应液，置于37 ℃恒温箱中避光反应30 min；PBS冲洗3次，DAPI染色液复染细胞核7 min；PBS冲洗3次，90%甘油封片，采用荧光显微镜观察各组细胞凋亡情况，每组细胞随机选取6个不同区域进行拍照，数据处理选用Image Pro Plus软件，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率用绿色荧光细胞核(TUNEL)占蓝色荧光细胞核(DAPI)的百分比来表示。

1.5 各组细胞ROS及MMP检测 采用激光共聚焦显微镜测算两组细胞ROS和MMP。心肌细胞缺血复灌完成后取各组细胞，吸弃上清液，分别加入含1 μg/mL Jc-1和5 μmol/L DCF-DA染料的染色液，37 ℃孵育30 min，吸弃染色液，PBS冲洗3次，将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。扫描参数为分辨率：1 024×1 024，放大倍数为100倍。每组细胞随机选取6个视野，每次实验重复3次，采用激光共聚焦显微镜自带分析软件LSM710进行数据分析，统计各通道的平均荧光强度，结果以与正常组的比值表示。

1.6 各组心肌细胞HSP60、Prx2、Trx1、Fis1蛋白检测 采用Western blotting法。心肌细胞缺血复灌完成后，胰酶消化、离心，用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。各组取30 μg总蛋白，12% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，5% BSA室温封闭1 h，加入一抗HSP60、Prx2、Trx1、Fis1、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加入HRP标记的二抗(1∶3 000)室温孵育1 h，TBST洗3次，ECL进行显影，凝胶成像仪进行扫描并分析条带灰度值。GAPDH为内参，每组样品重复检测3次。以目的条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料采用表示，结果比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A、B组心肌细胞活性分别为0.77±0.01、0.40±0.02，二者比较，P<0.05。A、B组心肌细胞凋亡率分别为2.24%±0.12%、41.78%±1.43%，二者比较，P<0.05。A组细胞ROS和MMP分别为58%±2%、112%±5%，B组分别为113%±5%、76%±1%，组间比较，P均<0.05。各组心肌细胞HSP、Prx2、Trx1、Fis1蛋白的相对表达量见表1。

表1 两组心肌细胞HSP、Prx2、Trx1、Fis1蛋白相对表达量比较

3 讨论

以往研究[5]表明，心肌缺血复灌中细胞内氧化应激反应来源于各种途径，产生大量活性氧，其在线粒体内的大量堆积是造成细胞凋亡的主要原因；细胞内及线粒体内钙超载也发生于急性心肌缺血时期并在复灌初期急剧增加，导致mPTP的开放，线粒体膜电位下降[1]。目前临床上尚无有效避免心肌缺血再灌注损伤的治疗方法，因此对于复灌损伤氧化应激相关分子机制的研究具有重要意义。本研究主要联合应用两种缺氧方法，除维持细胞内外电解质平衡的离子外，另外添加2-脱氧葡萄糖来抑制糖酵解，并通过加入乳酸钠来模拟体内环境中“酸中毒”现象，此外联合应用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)来清除培养基中的氧气，该条件下细胞增殖活性显著下降，细胞凋亡率增加。在正常生理条件下，线粒体也会不断产生ROS，线粒体电子传递链95%～98%的O2·反应后都转化为H2O而不产生任何的自由基中间体；而剩余的2%～5%的O2·则会通过其他途径产生一些超氧化物和H2O2·。此时所产生的少部分ROS会通过自身的一系列抗氧化系统如谷胱甘肽还原酶(GSH)、硫氧还原蛋白还原酶(TrxR)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)来清除；此外，一些抗氧化食物如维生素E、黄酮类、多酚类化合物也会清除一部分ROS。但是在心肌缺血时机体自我平衡系统被打破，复灌时会产生大量的ROS，此时mPTP开放引起线粒体功能的紊乱，通常主要表现为线粒体去极化、ATP合成受阻、细胞内Ca2+释放及呼吸抑制等；同时会引起线粒体基质肿胀，释放细胞色素C、核酸内切酶G等一系列促凋亡蛋白，启动Caspase-3级联凋亡反应，进一步加剧心肌缺血再灌注损伤[8]。

线粒体功能障碍被认为是氧化应激诱导的组织损伤的一个重要的因素。有文献报道[9]，HSP60是一种线粒体基质应激诱导蛋白，其对线粒体蛋白质的折叠和功能具有很重要作用，且HSP60分布相当广泛，机体遭受应激反应后，其变化最为显著，是主要的应激蛋白。因此通过研究HSP60在心肌缺血再灌注时的变化趋势可更清楚地了解心肌缺血再灌损伤机制。而影响线粒体功能的另一个因素便是由线粒体分裂相关蛋白介导的线粒体分裂，Fis1作为线粒体外膜上Drp1的受体，主要参与Drp1的募集从而促进线粒体的分裂，线粒体的分裂进一步加重氧化应激反应，有研究称这是由于细长状线粒体比点状线粒体更能容纳线粒体内钙超载和复灌时大量爆发的ROS[10]。Prx2是近几年发现抗氧化酶家族中的一员，被发现在细胞内具有抗过氧化和调节H2O2·的功能，介导信号转导作用以及细胞内抗ROS的防御作用[11]。Trx主要分为Trx1和Trx2两种类型，Trx1主要位于细胞质中，Trx2仅位于线粒体中，其中Trx1研究的最广泛。有研究表明Trx1具有抗凋亡、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、保护再灌注损伤和调节蛋白质的亚硝基化等作用[12]。其抗氧化机制主要包括两方面：①能直接或间接作为某些过氧化物酶的电子供体清除活性氧，从而减弱脂质、DNA、蛋白质等过氧化损伤。②作为细胞内蛋白二硫键还原酶，它能还原多种蛋白质(激酶、磷酸酶和转录因子)的二硫键，使其恢复生理功能，故其在抗氧化、维持细胞生理活性过程中具有重要作用[13]。

本研究发现，心肌缺血复灌后HSP60蛋白表达水平显著升高，这也可以作为心脏疾病中的重要标志物；Fis1蛋白表达水平升高也提示线粒体发生分裂，线粒体动态网络结构被打破，从而加剧细胞损伤；Prx2和Trx1蛋白表达水平显著下降，说明细胞自身抗氧化能力减弱，Prx2发挥抗氧化的功能跟Trx1之间有着紧密的联系。有研究表明，在氧化应激的情况下，过度消耗Prx2会减少Trx的激活和表达，从而导致细胞凋亡信号调节激酶激活，即通过Trx-ASK1-JNK信号通路调节细胞的凋亡[14]。

综上所述，总缺血再灌注后H9c2心肌细胞出现细胞活性下降、细胞凋亡，其机制可能与缺血再灌注可促进细胞HSP60、Fis1蛋白表达，抑制Prx2、Trx1蛋白表达有关。

[1] Hausenloy DJ ，Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target[J]. J Clin Invest, 2013,123(1):92-100.

[2] de Groot H, Rauen U. Ischemia-reperfusion injury: processes in pathogenetic networks: a review[J]. Transplant Proc,2007,39 (2):481-484.

[3] Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury[J]. N Engl J Med,2007,357(11):1121-1135.

[4] Aon MA, Cortassa S, Marbán E, et al. Synchronized whole cell oscillations in mitochondrial metabolism triggered by a local release of reactive oxygen species in cardiac myocytes[J]. J Biol Chem, 2003,278(45):44735-44744.

[5] 涂启敏, 陈智群. 热休克蛋白60与心血管疾病关系的研究进展[J].医学综述,2009,14(15):2100-2102.

[6] Gerald W, Dorn M. Mitochondrial dynamism and heart disease: changing shape and shaping change[J]. EMBO Mol Med, 2015,7(7):865-877.

[7] Markou T, Makridou Z, Galatou E, et al. Multiple signalling pathways underlie the protective effect of levosimendan in cardiac myocytes[J]. Eur J Pharmacol, 2011,667(1-3):298-305.

[8] Petronilli V, Penzo D, Scorrano L, et al. The mitochondrial permeability transition, release of cytochrome c and cell death. Correlation with the duration of pore openings in situ[J]. J Biol Chem, 2001,276(15):12030-12034.

[9] Lin KM, Lin B, Lian IY, et al. Combined and individual mitochondrial HSP60 and HSP10 expression in cardiac myocytes protects mitochondrial function and prevents apoptotic cell deaths induced by simulated ischemia-reoxygenation[J]. Circulation, 2001,103 (13):1787-1792.

[10] Chen H, Chomyn A, Chan DC. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction[J]. J Biol Chem, 2005,280(28):26185-26192.

[11] Boulos S, Meloni BP, Arthur PG, et al. Peroxiredoxin 2 overexpression protects cortical neuronal cultures from ischemic and oxidative injury but not glutamate excitotoxicity, whereas Cu/Zn superoxide dismutase 1 overexpression protects only against oxidative injury[J]. J Neurosci Res, 2007,85(14):3089-3097.

[12] Saitoh M, Nishitoh H, Fujii M, et al. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) [J]. EMBO J, 1999,117(9):2596-2606.

[13] Masutani H, Bai J, Kim YC, et al. Thioredoxin as a neurotrophic cofactor and an important regulator of neuroprotection[J]. Mol Neurobiol, 29(3):229-242.

[14] Kalinina EV, Chernov NN, Saprin AN. Involvement of thio-, peroxi-, and glutaredoxins in cellular redox-dependent processes[J]. Biochemistry (Mosc), 2008,73(13):1493-1510.

Influence of ischemia reperfusion on viability and apoptosis of H9c2 myocardial cells and its mechanism

YANGYingying1,SUNXiaoou,TANWen

(1SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Objective To investigate the influence of ischemia reperfusion(IR) on cell viability and apoptosis of rat myocardial cells H9c2 as well as the potential molecular mechanism. Methods H9c2 cells were divided into groups A (control) and B (IR) and were seeded in 96-well plates by 1×104/well. After adhering for 24 h, the culture medium of group B was replaced by 100 μL hypoxia buffer and the cells were incubated in 94% N2, 1% O2, and 5% CO2for 90 min. Then we discarded the hypoxia buffer, and incubated them in normal environment with 100 μL/well DMEM of high glucose medium for another 90 min. The cell viability was detected by MTT, apoptosis by TUNEL, mitochondrial membrane potential (MMP) and reactive oxygen species (ROS) by laser scanning confocal microscope.Furthermore, heat shock protein 60 (HSP60), peroxiredoxin (Prx), thioredoxin (Trx) and mitochondria fission protein (Fis1) were detected by Western blotting. Results The cell viability of groups A and B was 0.77±0.01 and 0.40±0.02, respectively (P<0.05). The apoptosis rates in groups A and B were 2.24%±0.12% and 41.78%±1.43% (P<0.05). Intracellular ROS and mitochondrial membrane potential of group A was 0.58%±0.02% and 1.12%±0.05%, and was 1.13%±0.05% and 0.76%±0.01% in the group B (allP<0.05). Compared with group A, the expression levels of HSP60 and Fis1 were increased, and the levels of Prx2 and Trx1 were decreased (allP<0.05). Conclusion After ischemia reperfusion, the cell viability decreases and the apoptosis increases in H9c2 cells, and its mechanism may be that ischemia reperfusion promotes the expression of HSP60 and Fis1 protein and inhibits the expression of Prx2 and Trx1 protein.

ischemia reperfusion; H9c2 cardiomyocytes; cell viability; apoptosis; reactive oxygen species; mitochondrial membrane potential; heat shock protein 60; peroxiredoxin; thioredoxin; mitochondrial fission protein

华南理工大学自然科学基金资助项目(D2154630)。

杨莹莹(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为心血管药理。E-mail： yangyingxz@163.com

简介： 孙晓鸥(1984-)，女，博士，讲师，主要研究方向为细胞生物学。E-mail: bixosun@scut.edu.cn

谭文(1958-)，男，博士，教授，主要研究方向为医药生物学。E-mail: went@scut.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.005

R965

A

1002-266X(2016)39-0016-04

2016-05-26)