籼米黄淀粉中蛋白质的功能性质

杨有望 高文明 易翠平 谢 涛 周素梅

(长沙理工大学化学与生物工程学院 健康谷物制品研究所1，长沙 410114) (湖南工程学院化学化工学院2，湘潭 411104) (中国农业科学院农产品加工研究所3，北京 100193)

籼米黄淀粉中蛋白质的功能性质

杨有望1高文明1易翠平1谢 涛2周素梅3

(长沙理工大学化学与生物工程学院 健康谷物制品研究所1，长沙 410114) (湖南工程学院化学化工学院2，湘潭 411104) (中国农业科学院农产品加工研究所3，北京 100193)

以分别经中性蛋白酶和二硫苏糖醇(DTT)处理的籼米黄淀粉或灿米黄淀粉蛋白样品为对照，对籼米黄淀粉中蛋白质的形态结构、功能性质及其对黄淀粉糊化性质的影响进行了研究。结果表明，籼米黄淀粉中的蛋白质是以小蛋白体的形式结合在纤维素上面，并与淀粉相互作用，共同影响黄淀粉蛋白的功能性质；蛋白酶与二硫苏糖醇对这种结构能造成一定的破坏；籼米黄淀粉蛋白分子结构中存在相当数量的二硫键，且二硫键遭受破坏的程度、蛋白分子中肽片段的多少以及分子间相互作用的强度同样影响到籼米黄淀粉蛋白的各种功能性质。

籼米 黄淀粉 蛋白质 功能性质

蛋白质作为籼米的第二大组成成分，对其糊化、回生等基本特性影响很大，进而影响其加工性质，但其具体的影响机理尚未阐明[1-4]。根据Osborne分类法，籼米中的蛋白质可以分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，这部分蛋白质可以用NaOH溶液提取、对淀粉糊化特性的影响已有相关研究[5]，但还有一部分蛋白质跟籼米淀粉结合紧密、通过碱液不能提取，例如用0.05 mol/L NaOH溶液碱提离心得到的黄淀粉层，就还含有4%左右的蛋白质，继续用碱液处理亦不能去除[5-6]，说明这部分蛋白质与淀粉可能有特殊的结合方式。因此，本论文首先分析了籼米黄淀粉中蛋白质不同状态下的功能性质，观察籼米黄淀粉中蛋白质的形态结构，并通过中性蛋白酶、二硫苏糖醇(DTT)处理后淀粉糊化性质的差异推测其结合键型，以期为阐明籼米黄淀粉中蛋白质在籼米食品加工中的地位和作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄淀粉蛋白质：采用淀粉酶水解制备，含水量14%，蛋白质质量分数为80.52%，其余为灰分等；大米总蛋白：采用碱提酸沉制备，含水量11%，蛋白质质量分数为88.43%。中性蛋白酶(酶活力200 000 U/g)、牛血清白蛋白、二硫苏糖醇(DTT)、氢氧化钠、磷酸二氢钾、考马斯亮蓝等均为分析纯。

722型可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；IKA T10匀浆机：广州市金晶穗达科学仪器有限公司；快速黏度测定仪RVA，Super-4：Newport scientific 公司；冷冻切片机 Leica CM1950、显微镜Leica DM4000 B LED：德国徕卡公司；DK-2000-L型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白酶与DTT处理样品的制备

以含水量14%的籼米黄淀粉蛋白为原料，按参考文献[8]的方法分别制得含水量仍为11%的中性蛋白酶与DTT处理的籼米黄淀粉蛋白样品。

1.2.2 溶解性的测定

将各种样品用pH 7.0 的0.05 mol/L 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液溶解[9]，25 ℃电磁搅拌1 h，3 000 r/min离心20min，用考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白质含量，由牛血清白蛋白作出标准曲线方程。蛋白质的溶解性=上清液中蛋白质含量/原料中总的蛋白质含量×100%。

1.2.3 起泡性和起泡稳定性的测定

[10]：将样品用 pH 7.0的 0.05 mol/L 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液配成 1 mg/100 mL 的溶液，取 100 mL 倒入高速组织捣碎机中，在10 000 r/min下搅拌 1 min；倒入 250 mL 量筒，尽快记录泡沫体积(V0) 。蛋白质的起泡性 FC=(V0-100)/100×100%，起泡稳定性用失水率表示，即将上述体系静置 30 min 后，测出下层析出液的体积(Vt)。失水率=Vt/V0×100%。

1.2.4 乳化性和乳化稳定性的测定

采用浊度法[11]：以0.5%的样品溶液20 mL, 边搅拌边加入纯大豆色拉油10 mL, 然后以8 000～10 000 r/min 的速度高速匀浆2 min 制成乳状液, 用微量注射器从底部抽取乳状液50 μL, 放入一小烧杯中。然后加入25 mL 0.1% 的十二烷基璜酸钠(SDS) 溶液制成混合液, 在500 nm 的波长下测吸光值E0, 该值为乳化活性指数(EAI) ,再过20 min 测吸光值E20, 乳化稳定性指数(ESI)用以下公式计算:ESI=E0×20/(E0-E20)。

1.2.5 持水、吸油能力的测定

采用重量法[12]。持水性：准确称取样品0.3 g于离心管中，加入4 mL 水，放入带刻度离心管中，用细金属丝搅拌1 min, 使样品分散于水中，40 ℃水浴放置30 min, 在500 r/min离心25 min, 读出游离水的体积。WHC (mL/g)=(4-游离水体积)/0.3。

吸油性：准确称取样品0.4 g于离心管中，加入4 mL金龙鱼调和油，放入带刻度离心管中，用细金属丝搅拌1 min, 使样品充分分散，静置30 min, 在2 000 r/min离心25 min, 读出游离油的体积，通过总油与未被吸附油的体积之差, 测其吸油性：吸油性(mL/g)=(4-游离油体积)/0.4。

1.2.6 黄淀粉的形态结构

采用组织切片的方法：样品0.25 g+2 mL水，在60、80、90 ℃分别水浴搅拌10 min，2 000 r/min转离心 2 min，取沉淀在-16 ℃ 低温恒冷，切片成3 μm厚，置于载玻片上，Lugols碘染色30 s，流水漂洗，甘油封片，用光学显微镜 Leica DM4000 BLED观察黄淀粉中主要成分的形态结构，软件 LAS V4.1处理图片。

1.2.7 黄淀粉的糊化性质分析

采用快速黏度测定仪(RVA)测定[13]：称取样品 3.0 g(干基)，加入蒸馏水25 mL，制备测试样品。在搅拌过程中，罐内温度变化如下：50 ℃保持1 min；以 12 ℃/min速率上升到95 ℃(3.75 min)；95 ℃保持 2.5 min，以12 ℃/min降到50 ℃(3.75 min)；50 ℃保持1.4 min。搅拌器在起始 10 s内转动速度为960 r/min，之后保持在160 r/min。得到米粉的糊化特性曲线，其中峰值黏度(单位为RVU，下同)、热糊黏度、崩解值(最高黏度与热糊黏度之差)、最终黏度、回生值(最终黏度与热糊黏度之差)、糊化温度(℃)是反映不同样品RVA谱差异的重要特征值。

1.2.8 数据处理

所有数据均为3次试验的平均值，采用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 籼米黄淀粉蛋白的功能性质

2.1.1 溶解性

蛋白质的功能性质及应用性能很大程度上取决于其溶解性[10]。对于结构比较完整的蛋白质而言，它们的溶解性较差，如籼米蛋白及其黄淀粉蛋白的溶解度均在10%左右(见图1)，且两者差异不显著(P>0.05)。与籼米黄淀粉蛋白相比，经中性蛋白酶处理后的黄淀粉蛋白的溶解度显著增高到38.11%，增加了4倍多(P<0.01)，这是由于蛋白质遭受了蛋白酶的强烈破坏而降解成了水溶性更强的多肽[8]；而经DTT处理后的黄淀粉蛋白的溶解性尽管也增加了2倍(P<0.05)，但增加倍数远低于经蛋白酶处理的黄淀粉蛋白，这是因为DTT虽然可以裂解二硫键破坏其网络结构从而增加其溶解性[8]，但蛋白质的分子结构并没有遭受严重破坏。

注：1 籼米蛋白，2 黄淀粉蛋白， 3 蛋白酶处理的黄淀粉蛋白， 4 DTT处理的黄淀粉蛋白。

图1 4种蛋白的溶解性

2.1.2 起泡性与起泡稳定性

由图2可见，与籼米蛋白相比，籼米黄淀粉蛋白的起泡性与起泡稳定性都有所下降，但差异不显著(P>0.05)。然而，籼米黄淀粉蛋白经中性蛋白酶处理后，其起泡性与起泡稳定性都有显著提高(P<0.05)，这是由于经适当酶解处理后蛋白质肽片段数增加、分子间的各种相互作用力也随之增加，蛋白质分子通过重排、铺展以及相互间结合形成坚韧的界面膜，以形成更多的泡沫并防止其破裂[15]。另外，经DTT处理的籼米黄淀粉蛋白，其起泡性与起泡稳定性的变化均不显著(P>0.05)，这可能是DTT处理仅破坏了蛋白质分子的空间网络结构，蛋白质分子间的范德华力、氢键及疏水相互作用等均未发生大的变化[8,15]。

注：1 籼米蛋白，2 黄淀粉蛋白， 3 蛋白酶处理的黄淀粉蛋白， 4 DTT处理的黄淀粉蛋白。下同。

图2 4种蛋白的起泡性与起泡稳定性

2.1.3 乳化性与乳化稳定性

蛋白质乳化现象的形成是由于蛋白质的疏水氨基酸与脂肪球表面结合，而亲水氨基酸与水分子结合从而形成一层薄膜覆盖在脂肪球表面，使脂肪球悬浮分散于水溶液中，形成乳状液[15-16]。与溶解性相类似，对于结构比较完整的籼米蛋白与籼米黄淀粉蛋白，它们的乳化性能几无差别(P>0.05，见图3a)，但乳化稳定性则是后者高于前者约1倍(P<0.05，见图3b)，这可能是由于黄淀粉蛋白样品中含有较多的矿物成分，能够形成有利于使蛋白质起泡性能增强的离子强度，也即促进蛋白质在乳状液界面的絮凝和聚结。再由图3a可看出，尽管经DTT处理的籼米黄淀粉蛋白的乳化性要稍低于经蛋白酶处理的籼米黄淀粉蛋白的乳化性(P>0.05)，但显著高于籼米黄淀粉蛋白的乳化性(P<0.05)，这说明经蛋白酶与DTT的适度处理有利于蛋白质疏水氨基酸、亲水氨基酸的暴露，增强其乳化能力。但是，籼米黄淀粉蛋白及其分别经蛋白酶、DTT处理后的蛋白样品的乳化稳定性差别不显著(P>0.05，见图3b)，表明这3个蛋白样品中维持乳状液稳定存在的相互作用强度相当。

图3 4种蛋白的乳化性与乳化稳定性

2.1.4 吸油性与持水性

吸油性反映蛋白质基质吸附油的能力，而持水性则反映了蛋白质基质保留水的能力。由图4可知，对于这4个蛋白样品，它们的吸油性与吸水性基本相等，两者由强到弱的顺序依次为经蛋白酶处理的黄淀粉蛋白>经DTT处理的黄淀粉蛋白≈黄淀粉蛋白>籼米蛋白，这说明经蛋白酶处理后蛋白质中的亲水与疏水性氨基酸暴露得最充分(P<0.05)，而分别经DTT与碱处理后，这些氨基酸的暴露相对要弱些(P>0.05)。

图4 4种蛋白的吸油性与持水性

2.2 籼米黄淀粉中蛋白质的存在形态

Zheng等[14]采用组织切片法研究了谷粒糊粉层、次糊粉层和淀粉胚乳中蛋白质的聚集状态，发现这些蛋白质呈A、B、C 3种结构形态。采用这种方法，研究了籼米黄淀粉中的蛋白质在未糊化(60 ℃)、糊化点(80 ℃)及超过糊化点(90 ℃)3个温度下的结构形态，如图5所示。由图5可见，在黄淀粉中存在较多的类似于A、B、C的结构(图5a)，将A、B、C放大(图5b)可以观察到，这种结构实际上是蛋白质以小蛋白体的形式结合在纤维素上面，共同与淀粉相互作用，以影响籼米黄淀粉及其蛋白的功能性质。具体地，A是黄淀粉未糊化时，颗粒清晰的小蛋白体和纤维素较为松散的结合；B是黄淀粉在糊化温度时，蛋白体附着在纤维素上、包和在一起形成圈状伸展开来；C是黄淀粉在超过糊化温度10 ℃时，结合成圈状的蛋白体和纤维素断裂，形成线条状结构。这些籼米黄淀粉糊化过程中的蛋白质的存在形态也可能是其影响籼米粉或黄淀粉糊化特性的行为方式。

图5 黄淀粉的组织结构

2.3 黄淀粉中蛋白质对其糊化特性的影响

表1反映了黄淀粉中蛋白质对其糊化特性的影响。由表1可知，籼米粉的峰值黏度、热糊黏度、回生值、最终黏度均显著低于籼米黄淀粉的(P<0.05)，而糊化温度显著高于籼米黄淀粉(P<0.05)，这与我们前期发现峰值黏度值与蛋白质含量呈负相关的研究结果一致[6]。DTT是蛋白质中二硫键的还原剂，可用于阻止蛋白质分子内或分子间二硫键的链接。中性蛋白酶主要是将蛋白质分子降为小分子肽类，从而使改变蛋白质与淀粉的作用方式。表1的结果发现黄淀粉+DTT和黄淀粉+蛋白酶的峰值黏度、热糊黏度、回生值、最终黏度均极显著高于籼米粉和黄淀粉(P<0.01)，且黄淀粉+DTT又极显著高于黄淀粉+蛋白酶(P<0.01)，说明蛋白质结构形态对黄淀粉的糊化性质有影响，这与Xie等[1,13]的研究结果一致。此外，黄淀粉用DTT处理后糊化黏度值高于用蛋白酶处理的，说明黄淀粉蛋白质的分子内和分子间多以二硫键链接，它们对黄淀粉糊化性质的影响超过了松散结构的蛋白肽；也就是说，经蛋白酶处理更有利于减弱蛋白质对淀粉糊化的抑制作用，使淀粉颗粒膨胀增大，耐剪切力减弱，淀粉颗粒破裂度增大。

3 结论

3.1 籼米黄淀粉蛋白与籼米蛋白的溶解性、起泡性、起泡稳定性及乳化性能比较接近，但籼米黄淀粉蛋白经蛋白酶和DTT处理后，其溶解度显著增高。籼米黄淀粉蛋白经蛋白酶处理后，其起泡性与起泡稳定性都显著提高。无论经DTT处理还是经蛋白酶处理后的籼米黄淀粉蛋白的乳化性能相当，且较之籼米黄淀粉蛋白的有显著增加，但三者的乳化稳定性差别不大。

表1 黄淀粉中蛋白质对其糊化特性的影响

3.2 籼米黄淀粉中的蛋白质是以小蛋白体的形式结合在纤维素上面，共同与淀粉相互作用，以影响籼米黄淀粉蛋白质的功能性质；蛋白酶与DTT能破坏这种结合。

3.3 与籼米粉相比，籼米黄淀粉的峰值黏度、热糊黏度、回生值、最终黏度均要高很多，而糊化温度却要低得多；籼米黄淀粉经DTT和蛋白酶处理后，其峰值黏度、热糊黏度、回生值、最终黏度均显著增高，且前者又明显高于后者。

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Properties of Protein in Yellow Starch from Non-Waxy Rice

Yang Youwang1Gao Wenming1Yi Cuiping1Xie Tao2Zhou Sumei3

(School of Chemistry and Biological Engineering1, Changsha University of Science and Technology,Institute of Healthy Cereal Product1, Changsha 410114)(College of Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering2, Xiangtan 411104)(Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences3, Beijing 100193)

This study was to investigate the functional properties and pasting properties with its structure of protein in yellow starch from non-waxy rice (PYS-NR) treated by neutral protease and dithiothreitol (DTT). Results indicated that the solubility of PYS-NR was increased because of different protein structure formation treated by protease and DTT, the emulsification of them was almost the same, both higher than that of PYS-NR; and the foaming ability was increased significantly with foam stabilities. The protein was bonded on the fibrin as small protein body in PYS-NR, and their main existence forms were different under different temperature conditions, which might be the reason that led to peak viscosity, hot paste viscosity, setback and final viscosity of PYS-NR increased, and breakdown and paste temperature decreased. The peak viscosity, hot paste viscosity, setback and final viscosity of PYS-NR were also increased after being treated by protease and DTT, and the value of protease was lower significantly than DTT.

PYS-NR, functional properties, pasting properties, structure

TS236

A

1003-0174(2016)10-0050-06

国家自然科学青年基金(31301404)

2015-01-13

杨有望，男，1990年出生，硕士，粮食油脂与植物蛋白工程

易翠平，女，1973年出生，教授，粮食、油脂与植物蛋白工程