响应面优化α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉工艺研究

耿敬章

(陕西理工大学生物科学与工程学院，汉中 723000)

响应面优化α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉工艺研究

耿敬章

(陕西理工大学生物科学与工程学院，汉中 723000)

以银杏为原料，研究α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉工艺。以银杏抗性淀粉得率为指标，探讨α-淀粉酶用量、pH、酶解温度、酶解时间、高压处理温度、高压处理时间、老化温度和老化时间对银杏抗性淀粉得率的影响。结果表明，响应面法优化α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳工艺条件：加酶量为8.0 U/g，pH为5.8，酶解温度为88.7 ℃，酶解时间为19.3 min，高压处理温度为120 ℃，高压处理时间为35 min，老化温度为3 ℃，老化时间为24 h，在该工艺条件下银杏抗性淀粉得率可达24.12%。为银杏抗性淀粉的开发提供参考。

银杏抗性淀粉 α-淀粉酶 制备 响应面优化

银杏在我国分布广，产量居世界第一[1]。银杏具有很好的食用价值和药用价值。银杏中的淀粉大约占其干重的60%～70%[2]。银杏以销售干果为主，其深加工产品很少。因此，银杏抗性淀粉的开发能使银杏资源得到充分利用，提高银杏的经济效益。

抗性淀粉是健康者小肠中不吸收的淀粉和淀粉水解物的总称[3]。作为一种新型的功能食品添加剂，抗性淀粉的开发应用引起了越来越多的关注。抗性淀粉可以降低糖尿病患者餐后血糖浓度，从而有效缓解糖尿病病情[4]；抗性淀粉可将肠道内有毒物质稀释，能增加大肠粪便体积，还可分解产生短链脂肪酸等代谢物，降低结肠pH值，可以减少肠道运送排泄物的时间，从而预防、治疗便秘、结肠癌等疾病；抗性淀粉可降低血中胆固醇和三酰甘油含量，从而降低患心脏病危险[5]。银杏回生抗性淀粉为糊化后又冷却老化的淀粉，其可在食品加工过程中由可消化淀粉转化而成，研究表明，平均聚合度(average degree of polymerization，DPn)在50～100的相对分子质量最利于抗性淀粉的生成[4-5]。所以，采用淀粉酶水解糊化淀粉来制备抗性淀粉必须严格地控制酶解程度。目前，α-淀粉酶水解制备木薯抗性淀粉[6]和马铃薯抗性淀粉[7]都取得较好的效果。而在银杏抗性淀粉的酶法制备方面，余海洋[8]采用普鲁兰酶法做了相关研究，有关α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的研究还鲜见报道。因此，本研究以银杏为原料，利用响应面分析法优化α-淀粉酶制备银杏抗性淀粉的工艺条件，以期为银杏资源的开发提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料与试剂

银杏：当地中药材批发市场；

高温α-淀粉酶(20 000 U/g)、胃蛋白酶(15 000 U/g)、葡萄糖淀粉酶(100 000 U/g)：美国Sigma公司；葡萄糖标准溶液、DNS试剂：广州鸿富化工有限公司。

1.2 试验仪器与设备

FY-135中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52AAA旋转蒸发仪：上海嘉鹏科技有限公司；TDL-40B低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 银杏淀粉的制备工艺流程[9]

银杏→干燥→破壳、去衣→粉碎→脱脂→NaOH溶液浸泡→匀浆→静置→滤上清液→NaOH溶液浸泡、搅拌过夜→离心→水洗淀粉数次→干燥→脱脂→干燥→银杏淀粉

1.3.2 银杏抗性淀粉的制备工艺流程

银杏淀粉→称重→溶解制成淀粉乳→Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液调pH→加入α-淀粉酶酶解→高压处理→自然冷却→放入冰箱老化→离心→干燥→粉碎→过筛→银杏抗性淀粉

1.3.3 银杏抗性淀粉含量的测定[10]

标准曲线的绘制：分别取葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)0.2、0.5、0.9、1.5、2.0、2.5 mL于6只容量瓶中，加入蒸馏水，加DNS试剂2 mL，加热5 min，冷却，蒸馏水定容，于540 nm处测定系列标准溶液的吸光度。经统计回归处理，得到线性方程为y=0.814 4x-0.007 5,R2=0.999 8，x指标准品的浓度,y指吸光度。

银杏抗性淀粉含量的测定：称取0.1 g样品，加HCl-KCl缓冲溶液调pH为3，加胃蛋白酶，恒温震荡50 min，离心。加乙酸钠缓冲溶液调pH为4，加葡萄糖淀粉酶，恒温震荡50 min，离心重复3次。用KOH溶液溶解沉淀，加HCl溶液中和，加乙酸钠缓冲溶液调pH为4。再加葡萄糖淀粉酶恒温震荡50 min，离心，收集上清液，重复3次。蒸馏水定容上清液至100 mL。取1 mL上清液，加DNS试剂，保温显色20 min。以试剂空白为0，在540 nm处测定样品的吸光度。

1.3.4 α-淀粉酶水解、预糊化银杏淀粉的工艺优化

根据单因素试验，选取加酶量、pH、酶解温度、酶解时间4个因素的最优试验范围，以银杏抗性淀粉得率为优化指标，采用响应面分析法对α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的工艺条件进行优化。

1.3.5 α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的后续工艺优化

[11]，在上述α-淀粉酶水解、预糊化银杏淀粉的最佳工艺基础上，选取高压处理温度、高压处理时间、老化温度、老化时间4个因素的最优试验范围，以银杏抗性淀粉得率作为优化指标，采用正交试验α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的后续工艺条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶水解、预糊化银杏淀粉的工艺优化

2.1.1 加酶量对银杏抗性淀粉制备效果的影响

设定制备银杏抗性淀粉时，pH为6.0，酶解温度为90 ℃，酶解时间为15 min，分别在加酶量为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 U/g 6个梯度下，按1.3.2制备银杏抗性淀粉并测其得率。由图1可以看出，当加酶量为8.0 U/g，银杏抗性淀粉得率达到最大值且之后逐渐减小。因为α-淀粉酶添加量的增加，使得淀粉的水解度增大，则直链淀粉分子被过度切分，从而影响其后续晶体的形成，进而导致银杏抗性淀粉得率降低。因此，α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳加酶量为8.0 U/g。

图1 加酶量、pH对银杏抗性淀粉制备效果影响

2.1.2 pH对银杏抗性淀粉制备效果的影响

设定制备银杏抗性淀粉时，加酶量为8.0 U/g，酶解温度为90 ℃，酶解时间为15 min，分别在pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 6个梯度下，按1.3.2制备银杏抗性淀粉并测其得率。由图1可以看出，当pH为6.0，银杏抗性淀粉得率达到最大之后却逐渐减小，主要是因为较高的pH抑制了α-淀粉酶的活性。因此，选择pH为6.0左右，银杏抗性淀粉的制备效果较好。

2.1.3 酶解温度对银杏抗性淀粉制备效果的影响

设定制备银杏抗性淀粉时，加酶量为8.0 U/g，pH为6.0，酶解时间为15 min，分别在酶解温度为75、80、85、90、95、100 ℃ 6个梯度下，按1.3.2制备银杏抗性淀粉并测其得率。由图2可以看出，当酶解温度为90 ℃时，银杏抗性淀粉制备效果较好。这可能是因为温度会影响α-淀粉酶的活性构象和其活性基团的解离状态，以及影响α-淀粉酶与底物分子的结合程度，从而改变酶促反应速率[12]。较低和较高的温度都会在一定程度上对抑制α-淀粉酶的活性。

2.1.4 酶解时间对银杏抗性淀粉制备效果的影响

设定制备银杏抗性淀粉时，加酶量为8.0 U/g，pH为6，酶解温度为90 ℃，分别在酶解时间为5、10、15、20、25、30 min 6个梯度下，按1.3.2制备银杏抗性淀粉并测其得率。由图2可以看出，当酶解时间为20 min时，银杏抗性淀粉达到最大值，且从此逐渐减小。这是因为随着酶解时间的延长，银杏淀粉被彻底降解为低聚糖以及小分子糊精，大量小分子的存在影响银杏淀粉的结晶老化，从而不利于银杏抗性淀粉的产生。因此，当酶解时间为20 min时，银杏抗性淀粉制备效果较好。

图2 酶解温度、酶解时间对银杏抗性淀粉制备效果影响

2.1.5 α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的条件优化

结合单因素试验结果，分别选取加酶量为6.0、8.0、10.0 U/g，pH为5.0、6.0、7.0，酶解温度为85、90、95 ℃，酶解时间为15、20、25 min，利用响应面分析法优化α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳工艺参数。因素水平见表1，结果见表2。

表1 响应面因素水平

表2 α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉试验设计及结果

续表

对α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的条件进行分析，加酶量，pH、酶解温度、酶解时间都是显著因素。关于α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的得率二次回归拟合方程：

抗性淀粉得率/%=22.35+0.54×A-1.97×B-0.013×C-0.82×D-1.13×A×B-1.35×A×C-2.92×A×D-2.49×B×C+2.49×B×D-1.04×C×D-1.86×A2-3.15×B2-3.40×C2-1.69×D2

由表3可以看出，模型的P值为<0.000 1，而失拟项的P值为0.295 3，说明了α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的模型与实际情况拟合程度比较好，可以预测α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的条件。

表3 回归方程各项的方差分析

注：“P>F”<0.05，代表研究因素为显著因素。

由方差分析结果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都显著，相应曲面图见图3至图8。

图3 加酶量与pH交互作用对制备效果影响的响应面

图4 加酶量与酶解温度交互作用对制备效果影响的响应面

图5 加酶量与酶解时间交互作用对制备效果影响的响应面

图6 pH与酶解温度交互作用对制备效果影响的响应面

图7 pH与酶解时间交互作用对制备效果影响的响应面

图8 酶解温度与酶解时间交互作用对制备效果影响的响应面

根据α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的试验结果和回归方程各项的方差分析，由响应面分析法优化出α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳工艺条件，即α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳工艺条件为加酶量为8.0 U/g，pH为5.8，酶解温度为88.7 ℃，酶解时间为19.3 min。

2.2 α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的后续工艺优化

分别选取高压处理温度为110、120、130 ℃，高压处理时间为15、25、35 min，老化温度为3、6、9 ℃，老化时间为12、24、36 h，利用正交试验优化α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的后续工艺条件。因素水平见表4，结果见表5。

表4 因素水平表

表5 正交试验结果与分析

由表5可以看出，α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的后续工艺中各因素的主次顺序为B>A>D>C，即：高压处理时间>高压处理温度>老化时间>老化温度。α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的后续工艺条件最优组合为A2B3C1D2，即：高压处理温度为120 ℃，高压处理时间为35 min，老化温度为3 ℃，老化时间为24 h，此条件下银杏抗性淀粉得率达到24.12%。

3 结论

本试验对银杏回生抗性淀粉制备过程中淀粉酶酶解工艺和老化处理工艺进行了研究，响应面优化α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉的最佳工艺条件为：加酶量为8.0 U/g，pH为5.8，酶解温度为88.7 ℃，酶解时间为19.3 min，高压处理温度为120 ℃，高压处理时间为35 min，老化温度为3 ℃，老化时间为24 h，此时银杏抗性淀粉得率达到24.12%，研究结果可为银杏淀粉的进一步开发利用提供参考。

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Preparation of Ginkgo Resistant Starch with α-amylase by Response Surface Methodology

Geng Jingzhang

(College of Biological science and engineering, Shaanxi SCI-TECH University, Hanzhong 723000)

The preparation technology ofginkgoresistant starch by α-amylase hydrolysis was studied. Takingginkgoresistant starch yield as indicator, the effect of α-amylase amount, pH, enzymolysis temperature, enzymolysis time, high pressure processing temperature, high pressure processing time, storage temperature and storage time onginkgoresistant starch was studied. It showed that the optimum preparation conditions ofginkgoresistant starch by α-amylase hydrolysis using the response surface methodology were as follows: the enzyme amount for 8.0 U/g, pH for 5.8, enzymolysis temperature for 88.7 ℃, enzymolysis time for 19.3 min, high pressure processing temperature for 120 ℃, high pressure processing time for 35 min, storage temperature 3 ℃ and storage time 24 h .Under those conditions, theginkgoresistant starch yield reached 24.12%. This study provided a theoretical basis for the development and utilization ofginkgo.

ginkgoresistant starch, α-amylase, preparation, response surface optimization

TS235.4

A

1003-0174(2016)10-0025-06

陕西省教育厅专项科研计划(12JK0816)，陕西省社会发展攻关项目(2016SF-354)

2015-02-03

耿敬章，男，1980年出生，副教授，食品质量控制与资源开发利用