雄激素通过雄激素受体途径调控小鼠附睾Fkbp5Fkbp5基因的表达*

徐 迎陈 沁胡双纲**

1. 上海大学生命科学学院（上海 200444）；2. 上海交通大学医学院附属仁济医院生殖医学科；上海市辅助生殖与优生重点实验室

·论 著·

雄激素通过雄激素受体途径调控小鼠附睾Fkbp5Fkbp5基因的表达*

徐 迎1,2陈 沁1**胡双纲2**

1. 上海大学生命科学学院（上海 200444）；2. 上海交通大学医学院附属仁济医院生殖医学科；上海市辅助生殖与优生重点实验室

目的 初步研究小鼠附睾Fkbp5（FK506 binding protein 5）基因对雄激素的响应性以及相关的分子机制。方法 建立小鼠去势以及雄激素补充模型。采用RT-PCR以及RT-qPCR，检测正常小鼠、去势小鼠以及去势后补充外源雄激素的小鼠附睾中Fkbp5基因的mRNA表达水平。搜索染色体免疫共沉淀-测序（chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-seq）数据建立的小鼠附睾全基因组雄激素受体（androgen receptor, AR）结合位点的数据库，寻找与Fkbp5基因相关联的AR结合位点。利用AR抗体进行染色体免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP），采用ChIP-PCR以及ChIP-qPCR的方法，检测Fkbp5基因相关联的AR结合位点在体内与AR的结合情况。结果 去势后，Fkbp5基因的表达显著降低（P＜0.05）；补加雄激素后，Fkbp5基因的表达又升至正常水平（P＜0.05）。从小鼠附睾AR结合位点的数据库中鉴定到14个Fkbp5相关联的AR结合位点。ChIP-PCR结果显示，在正常生理状态下，这14个结合位点均与AR结合。ChIP-qPCR结果显示，去势后，这14个AR结合位点的富集倍数均显著下降（P＜0.05）；而补加雄激素后，这些AR结合位点的富集倍数又显著上升至生理水平（P＜0.05）。结论 Fkbp5在小鼠附睾内的表达受雄激素的正调控，并且是AR的一个直接靶基因。该研究首次证实了Fkbp5的启动子以及上游增强子区域存在雄激素响应元件，为探究雄激素/AR对Fkbp5的调控机制提供了新的视角。

雄激素; 雄激素受体; Fkbp5基因

附睾是雄激素依赖器官，其结构维持，功能发挥以及基因表达都受到雄激素的调控[1,2]。1973年，Orgebin-Crist等证实了雄激素对附睾内精子成熟的决定性作用[3]后，雄激素对附睾的调控作用得到深入的研究，从形态学水平，到生化水平，再到现在的分子水平[4]。雄激素的作用是由雄激素受体（androgen receptor, AR）介导的。AR是一种转录因子, 属于核受体超家族成员,一旦被雄激素激活, 便进入靶细胞的核内，以高专一性、高亲和力与雄激素应答元件（androgen response element, ARE）结合以调控基因转录[5,6]。因此，寻找和鉴定附睾内雄激素的靶基因以及与这些靶基因相关的AR结合位点（androgen receptor binding site, ARBS）和ARE，是阐明雄激素调控精子成熟的机制所必须的。

Fkbp5是免疫亲和素蛋白家族的一个成员，在免疫调节以及蛋白折叠和转运过程中发挥重要作用[7]。同时，有文献报道，Fkbp5还可以作为分子伴侣（chaperone）蛋白与AR结合进一步增强AR的配体结合活性以及转录调控活性[8]。Fkbp5也是雄激素的一个靶基因，在前列腺癌细胞系以及小鼠前列腺中，Fkbp5均受雄激素的正调控，并且对雄激素的响应性远比前列腺特异抗原基因（prostate specific antigen，PSA）快速而剧烈[9,10]，因此也被作为在体靶组织内研究雄激素调控机制的理想的模式基因。

目前，已经在Fkbp5的内含子区域和近端启动子区域鉴定到众多AR结合位点[9,10]，然而目前为止，在Fkbp5上游的远端增强子区域是否含有新的AR结合位点仍然未知。本研究工作表明，在小鼠附睾组织内，Fkbp5拥有14个AR结合位点，其中有4个位于上游的远端增强子区域。该研究为阐明AR对Fkbp5基因表达的快速调控机制提供了新的视角。

材料与方法

一、实验动物

健康10周龄雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验前在动物房喂养,自由进食和饮水。

二、主要试剂

Trizol（Invitrogen公司），37%甲醛溶液（Sigma公司），2x PCR Master Mix 及PowerUp™ SYBR®Green Master Mix （Thermo scientific公司），热启动Taq DNA聚合酶及ProtoScript®II First Strand cDNA Synthesis Kit（New England Biolabs公司），兔源AR多克隆抗体，正常兔IgG 以及protein A-agarose beads均购自Santa Cruz公司。Aprotinin，PMSF以及糖原均购自calbiochem公司。兽用丙酸睾酮注射液购自宁波第二激素厂。

三、方法

（一）小鼠去势和雄激素补充实验

参照文献[11]，稍作改进后如下：总共分为3个实验组，每组6只10周龄的雄性C57BL/6J小鼠。第1组，即正常组（normal，简称Nor组），手术当天处死取附睾组织。第2组，为补加玉米油组（castration+oil，简称oil组），在相同时间，用同样的方式注射与第3组相同体积的玉米油，作为平行对照试验。第3组，为补加雄激素组（castration+TP，简称TP组），在去势后7 d以及8d分别腹腔注射2.5mg/只剂量的丙酸睾酮。最后一次注射后24h，处死小鼠取附睾组织。在杀死小鼠前，通过摘眼球取血的方式收集血清。每组各取3只小鼠的附睾用来做ChIP实验，另外3只小鼠的附睾组织用于抽提组织RNA。本实验中，无小鼠意外死亡。血清中雄激素的含量在复旦大学放射性研究所通过放射免疫测定法测定。

（二）RNA提取及RT-PCR/ RT-qPCR

组织总RNA 的制备采用Trizol试剂，按照说明书操作。逆转录反应按ProtoScript®II First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程进行。以逆转录产物为模板进行RT-PCR或采用PowerUp™ SYBR®Green Master Mix进行RT-qPCR检测目标基因mRNA的表达水平。PCR所用引物见表1。

表1 本文用到的引物序列

（三）染色体免疫共沉淀（C h r o m a t i n immunoprecipitation，ChIP）

主要参照文献[12]的方法进行操作，简述如下：小鼠附睾组织于PBS中剪碎，并洗涤除去精子和管腔液。组织碎片经1%的甲醛室温交联后转入玻璃匀浆器于冰上匀浆40～50次，制成单细胞悬液，转入2 mL EP管，离心去上清。以SDS裂解液裂解细胞并进行超声处理以获得长度约为500～1000 bp的染色质。超声裂解液离心后保留上清。取15μL保存作为未经免疫沉淀的超声处理后样本对照（input），剩余的上清加入适量稀释缓冲液均分为两份，分别加入AR多克隆抗体或者正常兔源IgG，4 ℃孵育过夜。每个样品加入50μL protein A-agarose beads，4 ℃孵育2 h，分别用洗脱缓冲液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ以及TE缓冲液洗涤两次后，用洗脱缓冲液洗脱，经逆转交联及蛋白消化后，以乙醇沉淀的方法纯化DNA，最后溶于适量TE缓冲液中。

（四） ChIP-PCR及ChIP-qPCR

ChIP实验按上述方法进行。用Primer primier 5软件设计引物，用来扩增结合位点中心位置两侧大约100～150bp的DNA片段。以2μL 100倍稀释的超声处理后样本DNA（Input DNA），AR ChIPed DNA以及IgG ChIPed DNA 作为模板进行普通PCR（ChIP-PCR）或者采用PowerUp™ SYBR®Green Master Mix进行荧光定量PCR（ChIP-qPCR）分析。PCR所用引物见表1。

（五）生物信息学分析

采用MatInspector软件（Genomatix Software GmbH, http://www.genomatix.de/），在默认设置的情况下寻找AR结合位点内潜在的ARE元件。并通过在线的Weblogo软件（http://weblogo.berkeley.edu/logo. cgi）构建ARE的序列标示（sequence logo）。

（六）统计学分析

所有实验操作重复3 次，结果以均数±标准差表示，使用SPSS 11.0 软件对数据进行配对t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、各组小鼠血清睾酮水平

与正常组比较，去势后补加玉米油组小鼠血清睾酮水平显著降低（P＜0.01），注射外源性睾酮后，去势小鼠血清睾酮恢复到正常水平，见表2。

表2 各组小鼠血清睾酮水平比较（±s）

表2 各组小鼠血清睾酮水平比较（±s）

与Nor组比较，*为P＜0.01

组别睾酮水平 (ng/mL) Nor组 12.2±1.13 Oil组 0.6±0.14*TP组14.1±1.8

二、雄激素对小鼠附睾Fkbp5Fkbp5表达的调控

我们采用去势和外源雄激素补充实验研究了Fkbp5基因表达对雄激素的响应性。RT-PCR以及RT-qPCR结果表明，Fkbp5的表达与雄激素水平成正相关性。如图1A1A和图1B1B显示，去势后，Fkbp5基因的表达显著降低（P＜0.05），补充玉米油组的表达量仅是正常组的0.23±0.06倍；补加雄激素后，Fkbp5基因的表达又显著升高（P＜0.05），表达量与正常组基本持平，为正常组的（1.07±0.02）倍。用作阴性对照的Gapdh在正常组，补加玉米油组和补加雄激素组的表达均无显著变化（图1）。

图1 RT-PCR（A）和RT-qPCR（B）检测Fkbp5在正常小鼠（Nor组）、去势后补加玉米油小鼠（Oil组）和去势后补充外源雄激素小鼠（TP组）附睾内的表达情况非雄激素靶基因Gapdh用作阴性对照；与Nor组比较，*为P＜0.05，与Oil组比较，△为 P＜0.05

三、雄激素通过雄激素受体途径调控小鼠附睾Fkbp5Fkbp5基因的表达

从前期已经报道的AR ChIP-seq实验鉴定的小鼠附睾AR结合位点的数据库[12]中找到14个Fkbp5相关联的AR结合位点-ARBS1-ARBS14，其中8个位于内含子区域，2个位于启动子区域，4个位于上游增强子区域（图2A2A）。我们采用MatInspector软件预测了这些结合位点内是否含有雄激素响应元件（androgen responsive element，ARE），结果表明，除了ARBS11外，其余13个结合位点内均含有至少一个潜在的ARE元件（图2B2B）。将这些潜在ARE的序列进行多重比对，利用Weblogo软件，将这些序列的保守信息进行分析并图形化显示（图2C2C），发现这些ARE元件的保守序列与MatBase数据库中储存的经典的ARE序列（AGAACAnnnTGTTCT）极度相似。

图2 Fkbp5相关联的14个AR结合位点的位置，结合特性及ARE分析A:与Fkbp5关联的14个AR结合位点的分布；B:14个结合位点的结合特性分析；C:14个AR结合位点包含的保守的ARE序列。ARBS: 雄激素受体结合位点 AR binding site；TSS: 转录起始位点 transcription start site；ARE: 雄激素响应元件 androgen responsive element

我们接下来用ChIP-PCR验证了这些结合位点在体内与AR的结合情况。如图3所示，14个位点均被AR所结合，而用作阴性对照的Gapdh的启动子区（Gapdh promoter）的序列则没有AR的富集。

AR与DNA元件的结合是雄激素依赖性的，我们因此检测了AR与这些位点的结合是不是响应于雄激素的刺激。如图4所示，与Nor组相比，全部14个ARBSs在Oil组中的AR结合完全消失或显著降低，差异具统计学意义（P＜0.05）。在补加雄激素组（TP），14个ARBSs的AR结合比Oil组显著升高，差异具统计学意义（P＜0.05），并基本回复正常水平，表明AR与这些位点的结合是雄激素依赖性的。

讨 论

附睾作为男性生殖系统中的一个重要的附属性器官，不仅是精子运行的管道和储存的场所，也是精子成熟的主要器官。附睾是体内AR表达量最高的器官之一（www.nursa.org/10.1621/datasets.02001），并且附睾几乎所有的生理过程都是高度雄激素依赖性的。因此附睾是研究AR在体内生理状态下的调控规律的理想模型。

Fkbp5由于对雄激素的快速和完全响应而成为研究雄激素和雄激素受体调控机制的一个理想模式基因。我们的结果（图1）表明，在小鼠附睾内，Fkbp5的表达受到雄激素的完全正调控，这一结果与之前报道的前列腺中的Fkbp5的表达相一致。通过搜寻前期ChIP-seq实验得到的高分辨率的AR基因组结合位点数据库，并加以实验验证，我们确定了14个与Fkbp5相关的AR结合位点以及众多潜在的AREs，这表明Fkbp5是AR的一个直接靶基因。为了进一步佐证我们的结论，我们通过搜索附睾基因表达数据库（http://mrg.genetics.washington.edu/），明确了Fkbp5和AR在附睾不同区域的表达变化，结果如图5所示，AR基因和Fkbp5基因在附睾头部和体部表达量高，而在附睾尾部表达量低。 Fkbp5和AR在附睾组织内的相似的表达模式，也暗示了它们之间的正相关性。

图3 ChIP-PCR验证AR结合位点（ARBS1-ARBS14）在体内与AR的结合情况非雄激素靶基因Gapdh的promoter 序列用作阴性对照。IP：未经免疫沉淀的超声处理后样本DNA；AR：AR抗体免疫沉淀DNA；IgG：正常兔血清免疫沉淀DNA

图4 ChIP-qPCR验证AR结合位点（ARBS1- ARBS14）在体内与AR的结合对雄激素的响应性与Nor组比较，*为P＜0.05，与Oil组比较，△为P＜0.05

图5 Fkbp5和AR在小鼠附睾内的表达呈现正相关性A：Fkbp5和AR在小鼠附睾不同区域表达的平均信号值；B：Fkbp5和AR在小鼠附睾不同区域表达的示意图。基因表达数据来自http://mrg. genetics.washington.edu/

之前已经有一些关于Fkbp5的AR调控的研究，Magee等在小鼠前列腺中确认了一个位于intron 5的ARE[9]，在小鼠3017.1细胞系中鉴定到一个位于intron 1的PRE（progesterone response element）[13]。在我们的研究中，这两个位点都被ARBS覆盖，分别对应于图2A2A和图4的ARBS4和 ARBS8，表明它们在小鼠附睾中是真正的AR结合位点。在小鼠前列腺中并不被AR所结合的位于intron 5的另外一个ARBS（图2A2A和图4的ARBS5），在小鼠附睾中却是一个真正的AR结合位点，并且对AR的亲和性还很高。这或许反映了AR对Fkbp5调控的组织差异性。在我们的工作之前，还没有关于Fkbp5的5’上游远端增强子区域AR结合位点的报道。我们的结果显示了在小鼠附睾中AR对Fkbp5基因复杂的调控机制。

本研究中鉴定的与Fkbp5相关联的AR结合位点，大部分位于远离promoter区的内含子区域以及上游的远端区域，仅有少数位于近端启动子区。这种AR的调控模式在之前的研究中均已广泛报道[14,15]，这或许是AR在体内发挥调控作用的主要方式。这些远端的AR结合位点或许通过成环（looping）的方式作用于目标基因的启动子区从而调控基因表达，就如前列腺癌细胞中AR对PSA的调控那样[16]。AR对Fkbp5的复杂调控机制为我们阐明AR在小鼠附睾内的调控网络提供了新的角度。

1 Robaire B, Hamzeh M. Androgen action in the epididymis. J Androl 2011; 32(6): 592-599

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3 Orgebin-Crist MC, Tichenor PL. Effect of testosterone on sperm maturation in vitro. Nature 1973; 245(5424):328-329

4 Chauvin TR, Griswold MD. Androgen-regulated genes in the murine epididymis. Biol Reprod 2004; 71(2):560-569

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6 杨慎敏, 温端改. 雄激素受体与精子发生. 中国男科学杂志 2013; 27(8):65-68

7 Jaaskelainen T, Makkonen H, Palvimo JJ. Steroid upregulation of fkbp51 and its role in hormone signaling. Curr Opin Pharmacol 2011; 11(4):326-331

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9 Magee JA, Chang LW, Stormo GD, et al. Direct, androgen receptor-mediated regulation of the fkbp5 gene via a distal enhancer element. Endocrinology 2006; 147(1):590-598

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11 胡双纲, 姚广新, 孙赟. 雄激素/雄激素受体对小鼠附睾Caveolin-1表达调控的机制研究. 中华男科学杂志2013; 19(10): 867-872

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13 Magklara A, Smith CL. A composite intronic element directs dynamic binding of the progesterone receptor and gata-2. Mol Endocrinol 2009; 23(1):61-73

14 Wang Q, Li W, Liu XS, et al. A hierarchical network of transcription factors governs androgen receptor-dependent prostate cancer growth. Mol Cell 2007; 27(3):380-392

15 Yu J, Yu J, Mani RS, et al. An integrated network of androgen receptor, polycomb, and tmprss2-erg gene fusions in prostate cancer progression. Cancer cell 2010; 17(5):443-454

16 Wu D, Zhang C, Shen Y, et al. Androgen receptor-driven chromatin looping in prostate cancer. Trends Endocrinol Metab 2011; 22(12):474-480

（2016-07-08收稿）

Androgens regulate the expression of Fkbp5 through androgen receptor in mouse epididymis*

Xu Ying1,2, Chen Qin1**, Hu Shuanggang2**
1. School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China; 2. Reproductive Medical Center, RenJi Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University; Shanghai Key Laboratory for Assisted Reproduction and Reproductive Genetics

Objectivee To investigate the responsiveness of Fkbp5 (FK506 binding protein 5) on androgen manipulation in mouse epididymis and explore its related mechanisms. Metthhooddss The castration and androgen supplementation mouse model was established. The epididymide tissues from normal, castrated and castrated but supplemented with androgen mice were collected, and their total RNA were extracted. The expressions of Fkbp5 in epididymis tissues were detected by RT-PCR and RT-qPCR. AR binding sites associated with Fkbp5 were identifi ed by searching the database of genomewide AR binding sites established by ChIP-seq in mouse epididymis. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) using ARantibody was performed, and the in vivo AR occupancies on 14 sites associated with Fkbp5 were determined by ChIPPCR and ChIP-qPCR. Results ults After castration, the expressions of Fkbp5 were signifi cantly decreased (P ＜ 0.05); after use of androgen supplement, the expressions of Fkbp5 were elevated to normal level (P ＜ 0.05). Fourteen AR binding sites associated with Fkbp5 were found in the ChIP-seq database. The ChIP-PCR data showed that the fourteen AR binding sites were occupied by AR in physiological conditions. The ChIP-qPCR data revealed that the enrichment folds of 14 AR binding sites were remarkably decreased after castration, but were signifi cantly increased to normal conditions after use of androgen supplementation. Conclusionusion Fkbp5 was a bona fi de direct target gene of AR in mouse epididymis, and its expression was positively regulated by androgen. This study shed new light on understanding of androgen/AR regulatory network in mouse epididymis.

ords androgen; androgen receptor; Fkbp5 gene

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.08.002

Q 492.4

资助：本课题受国家自然科学基金（81571435，81200468）资助

**共同通讯作者，胡双纲，E-mail：shuangganghu@163.com；陈沁，E-mail: chenqincc@staff.shu.edu.cn