山东地区男性不育与CFTRCFTR基因M470VM470V多态性的关系

胡春风 刘红英

潍坊医学院遗传学教研室（潍坊 261053）

山东地区男性不育与CFTRCFTR基因M470VM470V多态性的关系

胡春风 刘红英*

潍坊医学院遗传学教研室（潍坊 261053）

目的 研究山东地区男性不育症患者和正常男性中的囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）基因M470V多态性分布情况，探讨CFTR基因M470V多态性与男性不育的关系。方法 收集临床诊断明确的轻度少精子症患者66例，重度少精子症患者59例，无精子症患者51例和生育力正常男性120例。外周血基因组DNA抽提，PCR技术扩增CFTR基因外显子10特定片段，Hph I限制性内切酶酶切方法分析M470V基因型和等位基因分布频率，DNA测序检测M470V SNP类型，应用SPSS17.0进行统计学分析，利用卡方检验，P＜0.05视为有显著性差异。结果 4组比较CFTR基因M470V 基因型和等位基因分布频率无统计学差异（P值均＞0.05）。结论 CFTR基因M470V多态性与少精子症及无精子症无关。

囊性纤维化跨膜传导调节因子; 不育,男性; 多态性, 单核苷酸

Key woorrddss cystic fi brosis transmembrane conductance regulator; infertility, male; polymorphism, single nucleotide

囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）基因的突变可使健康男性出现先天性双侧输精管缺如[1]、先天性单侧输精管缺如和梗阻性无精子症或精子质量下降，以至于造成男性不育[2-4]。M470V多态性是指CFTR基因外显子10上1540位点A、G碱基替换导致的氨基酸的改变，为错义突变，其突变等位基因M/V多态性可影响CFTR蛋白氯离子通道的内在活性[5-7]。虽然国外已有M470V多态性的相关报道，但我国人群M470V位点在CFTR基因上的多态性分布尚不十分清楚。本次研究检测精子发生正常男性人群与少精子症患者以及无精子症患者CFTR基因M470V多态性分布情况，探讨山东地区男性不育与CFTR基因M470V多态性的关系。

对象与方法

一、研究对象

收集潍坊医学院附属医院及潍坊市人民医院临床诊断明确的轻度少精子症男性患者66例，重度少精子症男性患者59例，无精子症男性患者51例以及生育力正常男性120例。所有患者均按照WHO第五版《人类精液检查与处理实验室手册》精液常规分析标准规定，精液分析连续3次，精子浓度均在10×106～15×106/mL的患者诊断为轻度少精子症，精子浓度均＜5×106/mL的患者诊断为重度少精子症，精液离心沉淀镜检未见精子的患者诊断为无精子症。采集外周血液标本2mL，EDTA抗凝，-20℃冰箱冷冻保存。

二、方法

（一）基因组DNA的提取

使用DNA抽提试剂盒（TIANamp Blood DNA Midi Kit中量血液基因组DNA提取试剂盒-离心柱型，北京天根公司）提取基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。利用超微量分光光度计（Gene Company Limited基因有限公司）测定DNA的浓度，OD值介于1.8～2.0之间的DNA留用，否则重新抽提。将提取的基因组DNA进行编号并冷冻保存于-80℃冰箱。

（二）引物设计与合成

根据引物设计一般原则及参考文献筛选上下游引物。上游引物：5’-TTGTGCATAGC AGAGTACCTGAAA-3’；下游引物：5’-GCTTCT TAAAGCATAGGTCATGTG-3’ 。该扩增片段长度为539bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成、纯化及鉴定。

（三）PCR技术

Golden Fast PCR Kit反应体系为40μL，基因组DNA 200ng，上下游引物各2μL，2×Golden Fast Reaction Mix 20μL，Golden Fast DNA Polymerase 0.8μL [天根生化科技（北京）有限公司]，加灭菌去离子水至终体积40μL。反应循环的参数为：94℃预变性 2min，94℃ 15 s，55℃ 5 s，72℃ 15 s，33个循环，72℃延伸2 min。反应结束后取6μL扩增产物，通过Gold ViewⅠ染色， 2%琼脂糖凝胶电泳，电压为100V，时间为1h，凝胶成像系统分析结果。

（四）Hph I 限制性内切酶酶切鉴定

酶切反应体系为20μL：10×NEB缓冲液2μL，PCR扩增产物10μL，Hph1内切酶0.5μL（NEB公司），加灭菌去离子水至终体积20μL。37℃温育4h，8μL酶切产物上样电泳，2%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，1h。凝胶成像系统分析并记录、保存实验结果，鉴定M470V基因分型。

（五）DNA测序

筛选出基因型为MM型和VV型的DNA样本，经PCR扩增后送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序，以检验扩增产物是否为目的片段以及扩增条带是否与电泳结果一致。

结 果

一、CFTRCFTR基因M470VM470V多态性位点PCR反应结果

M470V多态性位点PCR产物电泳图，如图1，片段长度为539bp，选用marker为50～500bp。电泳条带清晰、单一，特异性强。

图1 PCR产物电泳图注：1～7分别为不同检测对象的M470V位点PCR扩增片段

二、CFTRCFTR基因M470VM470V位点Hph I ph I 限制性内切酶酶切反应结果

酶切反应结果见图2，选用的m a r k e r为50～500bp。单一条带为纯合子MM型，片段长度为539bp；两条条带为纯合子VV型，片段长度分别为351bp和188bp；3条条带为杂合子MV型，片段长度分别为539bp，351bp和188bp。

三、DNADNA测序结果

测序结果见图3，CFTR基因M470V位点碱基为A，编码的氨基酸为Met；碱基为G，编码的氨基酸为Val。

图2 Hph酶切结果电泳图注：不同检测对象M470V位点酶切结果条带

图3 CFTR基因外显子10M470V多态性测序图

四、CFTRCFTR基因M470VM470V多态性位点基因型与等位基因频率

分别记录检测结果（见表1）。该人群中M470V多态性位点有3种基因分型：MM型、VV型和MV型，应用SPSS17.0统计学软件，利用x2检验进行统计学分析，将P＜0.05设为统计学显著性界值。

表1 M470V多态性位点基因型和等位基因分布频率

五、结果分析

4 组比较CFTR基因M470V 基因型和等位基因分布频率无统计学差异（P值分别为0.744和0.422，P值均＞0.05），即CFTR基因M470V多态性与轻度少精子症、重度少精子症及无精子症无关。MV基因型为最常见的基因型，在生育力正常男性人群中的基因型频率为0.467，其次为VV基因型，基因型频率为0.325，最少见的为MM基因型，基因型频率为0.208。MM、VV、MV基因型在生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律（x2=0.3472＜x20.05,1=3.84，P＞0.05）。V470等位基因为生育力正常男性人群中最常见的等位基因，其等位基因频率为0.558，M470等位基因与V470等位基因在生育力正常的男性人群中是分布比例约为0.8:1，相比欧洲白种人（1:1）偏低。

讨 论

CFTR基因于1989年被Riordan等[8]首次克隆并鉴定。CFTR基因定位于人类7号染色体长臂（7q31.2），有27个外显子，编码一条含1480个氨基酸残基的蛋白质[9,10]。CFTR基因外显子10上1540位点上碱基为A，编码氨基酸为甲硫氨酸（Met）；碱基为G，编码氨基酸为缬氨酸（Val）。M470V多态性本身与生育能力有关，欧洲人群Val470相比Met470生育能力更高[11]。为明确山东地区生育力正常男性人群与不育症男性患者之间M470V的分布情况，本文检测了正常男性人群与轻度少精子症、重度少精子症及无精子症患者CFTR基因M470V多态性的分布情况。我们的结果显示无显著性差异。这可能是以往的研究M470V位点大多与CFTR基因上其他位点相结合，而单纯的M470V改变在男性不育人群与正常人群中可能并无差异。目前关于M470V的研究多与CFTR基因内含子8上的TG重复次数、polyT相关，TG重复次数增加、polyT缩短与V470的结合均下调CFTR蛋白表达水平，导致先天性双侧输精管缺如（CBAVD）发生增加，甚至睾丸生精功能下降[12]。因此我们下一步的研究还需要大量的拓展到CFTR基因上TG重复次数、polyT等基因突变位点，探讨它们与M470V位点的作用相关性，进一步分析它们之间与男性不育的关系[13]，进而明确M470V与其他基因位点之间的协同作用。

目前对男性不育治疗的常用方法是卵细胞浆内单精子显微注射[14-16]技术。在美国及一些欧洲国家，CFTR基因多态性检测已应用于植入前遗传学诊断[17,18]。基因治疗[19]作为最常见的治疗手段，其效果远没有预期的好，但个性化治疗具有美好的前景。

同时，我们的结果表明MM、VV、MV基因型在山东地区正常男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律，M470等位基因与V470等位基因在生育力正常的男性人群中分布比例约为0.8:1，相比欧洲白种人（1:1）偏低。M470V位点是否会有与其他基因位点突变的协同作用[20]而影响患者生育能力，有待进一步进行相关研究。

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（2016-07-25收稿）

The relationship between CFTR gene M470V polymorphisms and male infertility in Shandong province

Hu Chunfeng, Liu Hongying*
Department of Genetics, Weifang Medical University, Weifang 261053, China Corresponding author: Liu Hongying, E-mail: hongyingwf@163.com

Objectivee To study the distribution of CFTR gene M470V polymorphisms between the male infertility patients and normal fertile male population in Shandong province, and to explore the relationship between CFTR gene M470V polymorphisms and male infertility. Metthhooddss Collecting defi nite diagnosed mild oligozoospermia 66 patients; severe oligozoospermia 59 patients; 51 patients with azoospermia and 120 cases of normal fertile male. Peripheral blood genomic DNA extraction, PCR amplifi ed CFTR gene exon 10 specifi c fragment, Hph I restriction endonuclease digestion method of analysis M470V genotype and allele frequencies, DNA sequencing to detect M470V SNP types, and SPSS17.0 statistical analysis was performed using the chi-square test, P＜0.05 considered to have significant differences. Resullttss Comparing four groups CFTR gene M470V genotype and allele frequency there was no signifi cant difference (P＞0.05). Concluussiioonn There was no relation between CFTR gene M470V polymorphisms and oligozoospermia and azoospermia.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.08.008

R 698.2

*通讯作者，E-mail: hongyingwf@163.com