鳕鱼皮寡肽对人胃癌细胞BGC-823增殖影响的实验研究

张国强 胡晓斐 续力云 吴丽萍

鳕鱼皮寡肽对人胃癌细胞BGC-823增殖影响的实验研究

张国强 胡晓斐 续力云 吴丽萍

目的 探讨鳕鱼皮寡肽（cod skin of oligopeptide，CSO）对人胃癌细胞（BGC-823）增殖的影响。方法 用不同浓度（20、40、60、80mg/ml）CSO处理体外培养的BGC-823，72h后显微镜下观察细胞生长情况；分别于24、48、72h，应用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算50%细胞抑制率（IC50）；处理后24h采用流式细胞术测定细胞凋亡及细胞周期的改变情况。结果 与对照组相比，经CSO处理后，镜下BGC-823数目减少。CCK-8检测结果显示，BGC-823数目减少呈剂量、时间依懒性（均P＜0.05），并且CSO对BGC-823作用24、48和72h的IC50分别是87.34、68.14、44.55mg/ml。对照组BGC-823存活率为（86.62±10.32）%，60mg/ml组BGC-823存活率为（24.18±6.59）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组BGC-823晚期凋亡率为（1.81±0.35）%，60mg/ml组BGC-823晚期凋亡率为（55.84±5.89）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。在G1期，对照组BGC-823细胞分布为（61.13±10.32）%，60mg/ml组BGC-823细胞分布为（79.74±10.21）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在S期，对照组BGC-823细胞分布为（23.04±8.64）%，60mg/ml组BGC-823细胞分布为（10.42±5.36）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在G2期，20mg/ml组BGC-823细胞分布为（9.96±2.68）%，40mg/ml组BGC-823细胞分布为（6.93±1.25）%，60mg/ml组BGC-823细胞分布为（9.84± 3.79）%，与对照组BGC-823细胞分布（15.83±5.89）%相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 CSO可阻滞BGC-823生长周期，促进BGC-823凋亡，抑制增殖，从而抑制肿瘤细胞的生长。

鳕鱼皮寡肽 人胃癌细胞 BGC-823 细胞周期 细胞凋亡

胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，很多患者确诊时已处于进展期，其复发率较高，5年生存率不高[1]。晚期胃癌患者大多需要化学治疗，但化疗药物无靶向性，不良反应多，已成为影响胃癌治愈率的关键[2]。近年来，各国学者致力于寻找低毒、高效的新型抗癌药物[3]。海洋生物中的活性物质寡肽因其具有抗癌、抗氧化、降脂等多种生理功能，而逐渐成为全世界科学家研究的热点[4-5]。本课题组于2015年8月，研究鳕鱼皮寡肽（cod skin of oligopeptide，CSO）体外对人胃癌细胞（BGC-823）增殖的影响，并初步阐述其抑癌作用机制，现报道如下。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料 BGC-823由上海吉玛制药技术有限公司。鳕鱼皮寡肽（Cod Skin of Oligopeptide，CSO）为鳕鱼深加工时鳕鱼皮的酶解产物。主要试剂：美国Gibco公司Trypsin-EDTA胰酶细胞消化液、10%胎牛血清、DMEM培养基；PI染液：10×PI配制，5mg PI（美国，Sigma公司），0.1ml Triton X-100，3.7mg EDTA，10ml PBS，RNaseA 2mg；AnnexinV-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒（KGA1017）。FACS Calibur流式细胞仪（美国，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 BGC-823培养及传代 细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，常规培养于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱。待BGC-823在6cm dish中培养至80%～90%密度时，倾去培养液，用3ml PBS洗涤细胞2次。加1ml Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置5min。再加入2ml含10%FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液，将细胞稀释至5×105细胞/ml。再传代培养至80%～90%密度待用。

1.2.2 细胞增殖试验（CCK-8法） 取对数生长期的BGC-823，按5×103细胞/孔的浓度接种96孔板，每孔加入培养基100μl。待培养过夜后，加入不同剂量的CSO处理，分为20、40、60、80mg/ml 4个浓度组，同时设立对照组（不加药物），并做好标识，继续培养，每24h更换1次培养液，至72h后，倾去培养液，加入新鲜培养基100μl后，每孔避光加入CCK8试剂10μl，避光培养1.5h后，选择450nm波长，用在酶标仪上测定各孔光密度值D450，重复实验3次。按下列公式计算细胞抑制率：肿瘤细胞抑制率（%）=（1-OD实验组/OD对照组）×100%。使用OriginPro 8.5软件做抑制曲线，计算IC50。

1.2.3 细胞周期检测（流式细胞术） 用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液消化处于对数生长期的BGC-823细胞离心收集，在含10%FBS的Ham F12培养液中培养。将细胞分为CSO20、40、60、80mg/ml 4个浓度组，同时设立对照组（不加药物）。细胞贴壁后，各浓度组作用24h，制成单细胞悬液，并调整细胞数量至1～5×106cells/ml。用100%乙醇（-20℃）1.5ml，使其终浓度为75%，4℃过夜固定。取出固定单细胞悬液在室温下1 000r/min离心5min后弃上清液，按照150μlRNaseA重悬细胞，37℃消化30min，加入100μl PI工作液，4℃避光染色30min。用流式细胞仪分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率。

1.2.4 细胞凋亡检测（流式细胞术） 细胞传代后培养至24h，分别加入CSO处理，分为20、40、60、80mg/ml组，同时设立对照组（不加药物）。作用至24h后，PBS洗3遍，用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细胞，微量离心机转速2 000r/min，离心时间5min，弃培养基。用冷PBS洗涤细胞2次（2 000r/min，离心时间5min收集细胞）；在50μl的Binding Buffer中加入5μl7-AAD染液，混匀。在收集的细胞中加入上述7-AAD染液，混匀；室温、避光、反应15min。反应后再加入450μl的Binding Buffer混匀；加入1μlAnnexin V-PE混匀，室温、避光、反应15min。在1h内用流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 CSO对BGC-823增殖的影响 见图1-2，表1。

由图1可见，经不同浓度CSO（20、40、60、80mg/ ml）处理后各组与对照组比较，细胞数量明显减少，细胞膜皱缩，细胞变圆，细胞碎片增多，且呈剂量依懒性。由表1及图2可见，随着时间与CSO浓度的增加，检测到OD值呈降低趋势，CSO对BGC-823的抑制率逐渐增大，作用24、48和72h的IC50分别是87.34、68.14、44.55mg/ml。

图1 CSO作用后BGC-823的镜下形态（a：对照组；b：20mg/ml组；c：40mg/ml组；d：60mg/ml组；e：80mg/ml组）

2.2 CSO对BGC-823凋亡的影响 见图3，表2。

由图3、表2可见，20、40、60、80mg/ml CSO处理BGC-823，观察24h细胞凋亡率发现，对照组细胞存活率与60mg/ml组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组细胞晚期凋亡率与60mg/ml组比较差异亦具有统计学意义（P＜0.05）。而两组早期凋亡率及死亡细胞率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。当浓度为80mg/ml，24h后活细胞极少，已无法染色，故无该浓度流式细胞检测实验数据。

2.3 CSO对BGC-823增殖周期的影响 见图4、表3。

由图4、表3可见，20、40、60、80mg/ml CSO处理BGC-823 24h后发现，在G1期，对照组与60mg/ml组细胞分布比较差异有统计学意义（P＜0.05）；在S期，对照组与60mg/ml组细胞分布比较差异有统计学意义（P＜0.05）；在G2期，对照组与20mg/ml组、40mg/ml组、60mg/ml组细胞分布比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 CSO对BCG-823细胞增殖的抑制作用（n=5）

图2 CSO作用于BGC-823不同时间后IC50（a：24h；b：48h；c：72h）

图3 不同浓度CSO作用于BGC-823后细胞凋亡图（a：对照组；b：20mg/ml组；c：40mg/ml组；d：60mg/ml组）

表2 BGC-823细胞凋亡数据统计（%）

3 讨论

上世纪50年代各国开始进行海洋生物抗肿瘤活性物质的研究，目前已有多项研究提示海洋生物寡肽具有抗癌的作用。Huang等[6]证实乌贼墨寡肽能显著抑制人前列腺癌DU-145细胞的增殖。Bach等[7]在盐场中发现一种嗜盐链霉菌属放线菌（Salternamide A，SA），能诱导大肠癌细胞的细胞周期阻滞和凋亡。Costa等[8]对208株海洋蓝藻的抗癌作用研究后，认为海洋蓝藻具有一定的细胞毒性，是一类很有前途的具有潜在抗癌活性的海洋生物。

图4 不同浓度CSO作用BGC-823后各组细胞周期图（a：对照组；b：20mg/ml组；c：40mg/ml组；d：60mg/ml组）

表3 BGC-823分布周期比较（%）

CSO是以水解、酶解蛋白和蛋白质多肽吸收理论为基础研发的一种全新海洋功能性食品，产品不仅实现了边角料高附加值利用的产业化问题，而且针对人体营养学需要，利用细胞和基因技术，研究鱼皮胶原蛋白肽在抗癌作用和增强免疫力生理功能，在满足人体氨基酸需求的同时又满足对肿瘤患者在放疗、化疗、术后恢复的抗癌辅助作用提供理论依据。为了研究开发新型海洋生物抗癌药物，充分利用海洋深加工下脚料，本课题组从深海鳕鱼皮中提取寡肽，并通过体外细胞培养、显微镜观察、CCK-8法检测、流式细胞术等实验方法，研究不同浓度（20、40、60、80mg/ml）CSO体外对BGC-823增殖及细胞周期与凋亡情况的影响。结果显示，CSO能抑制BGC-823增殖，且随着CSO浓度增高，增殖抑制更加明显。采用CCK-8法检测CSO作用后BGC-823 24、48、72h增殖情况变化，发现OD值随着CSO的浓度增加而降低，24、48、72h的 IC50分别是 87.34、68.14、44.55mg/ml，可见药物对细胞的抑制率随着浓度增加而增高，上述结果表明，CSO对BGC-823的增殖有抑制作用，且呈时间、量效关系。CSO细胞凋亡实验发现，BGC-823细胞随着CSO浓度增加，晚期凋亡细胞的比率增加，而活细胞比率则降低。60mg/ml的CSO加药后，细胞的晚期凋亡率平均值甚至从对照组的1.81%达到55.84%，活细胞比率平均值从对照组的86.62%降低至24.18%，说明高浓度CSO对于BGC-823细胞凋亡进展有显著影响。同时CSO的细胞周期实验检测发现，当CSO药物浓度达到60mg/ml时，G1期细胞分布由对照组的61.13%提升至79.74%，而S期和G2期细胞分布则由对照组的23.04%和15.83%降低至10.42%和9.84%。表明随着药物浓度的增大，S期细胞的数量明显降低，细胞均被抑制在G1期，导致了细胞增殖的停滞。

课题组应用酶法从鳕鱼皮中提取CSO，通过BGC-823体外加药实验，来研究CSO体外抗胃癌作用，结果证实CSO能抑制BGC-823增殖，促进凋亡，且呈时间、量效关系；同时能将细胞周期抑制在S/G2期，虽其具体机制还需进一步探究，但本研究结果为海洋生物应用价值和新型抗癌药物的开发利用提供了新的思路。

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Effect of cod skin oligopeptide on proliferation of human gastric carcinoma BGC-823 cells

ZHANG Guoqiang,HU Xiaofei,XU Liyun,et al.Department of Gastrointestinal Surgery,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

【 Abstract】 Objective To explore the effect of cod skin oligopeptide (CSO)on the proliferation of human gastric carcinoma BGC-823 cells. Methods BGC-823 cells were treated with different concentrations(20,40,60,80mg/mL)of CSO. Cell morphology was observed under the microscope,cell viability was determined by CCK-8 assay,and ell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry. Results CSO significantly suppressed the proliferation of BGC-823 cells in a time-and dose-dependent manner.IC50of CSO with 24h,48h and 72h were 87.34mg/ml,68.14mg/ml and 44.55mg/ml,respectively.The early apoptosis rate of BGC-823 cells was(17.55±5.48)%and the late apoptosis rate was(55.84±5.89)%,when the cells were treated with 80mg/ml CSO.After BGC-823 cells were treated with CSO for 24h,the cell cycle arrested at S/G2stage.The number of G1cells increased with the increasing of CSO concentration,peaked at(79.74±10.21)%when CSO concentration was 60mg/ml,the number of S/G2cells were decreased with the increasing of CSO concentration,reached the lowest value of(9.84± 3.79)%when CSO was 60mg/ml. Conclusion CSO can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of human gastric cancer BGC-823 cells.

Cod skin of oligopeptide Human gastric carcinoma cellBGC-823 Cell cycle Apoptosis

2016-06-21）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省自然科学基金项目（LY12C20002）；浙江省科技厅公益类项目（2011C23034）

316021 舟山医院胃肠外科

吴丽萍：E-mail：13605800815@126.com