基于计算机辅助水解和蛋白互作网络的珍珠母寡肽作用机制解析

陈艳昆　乔连生　霍晓乾　张栩　韩娜　张燕玲

[摘要] 珍珠母蛋白及活性肽是珍珠母發挥疗效的主要成分之一，解析其药效物质及作用机制具有重要研究意义。该研究利用计算机辅助水解和蛋白互作网络等模拟技术，获得珍珠母的活性寡肽成分，预测其潜在的作用靶标并解析珍珠母寡肽的作用机制。通过收集珍珠母的主要珍珠层蛋白序列，采用计算机辅助水解方法进行蛋白的模拟消化水解，构建了包含458条珍珠母水解寡肽的三维结构数据库。随后利用反向找靶技术预测珍珠母寡肽的作用靶点，并通过网络富集技术法对排名前20的关键靶点及其蛋白互作关系进行分析，获得12个功能模块。从系统角度理解各种生物学过程，发现珍珠母寡肽的作用靶点与神经系统相关疾病有密切关系，提示珍珠母寡肽具有能治疗中枢神经类相关疾病的功效。计算机辅助水解方法可以高效地对已知序列结构的珍珠母蛋白进行模拟水解，并结合蛋白互作网络，解析珍珠母寡肽治疗神经类疾病的作用机制。该研究为探讨中药寡肽类药效物质发现及作用机制解析的提供研究思路，为开展寡肽类中药设计研究提供了重要的技术支撑。

[关键词] 计算机辅助水解； 珍珠母； 蛋白互作网络； 反向找靶； 药效团； 寡肽

Pharmacological mechanism analysis of oligopeptide from Pinctada fucata

based on in silico proteolysis and protein interaction network

CHEN Yankun， QIAO Liansheng， HUO Xiaoqian， ZHANG Xu， HAN Na， ZHANG Yanling*

（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Pinctada fucata oligopeptide is one of key pharmaceutical effective constituents of P. fucata. It is significant to analyze its pharmacological effect and mechanism. This study aims to discover the potential oligopeptides from P. fucata and analyze the mechanism of P. fucata oligopeptide based on in silico technologies and protein interaction network（PIN）. First， main protein sequences of P. fucata were collected， and oligopeptides were obtained using in silico gastrointestinal tract proteolysis. Then， key potential targets of P. fucata oligopeptides were obtained through pharmacophore screening. The proteinprotein interaction（PPI） of targets was achieved and implemented to construct PIN and analyze the mechanism of P. fucata oligopeptides. P. fucata oligopeptide database was constructed based on in silico technologies， including 458 oligopeptides. Twelve modules were identified from PIN by a graph theoretic clustering algorithm Molecular Complex Detection（MCODE） and analyzed by Gene ontology（GO） enrichment. The results indicated that P. fucata oligopeptides have an effect in treating neurological diseases， such as Alzheimer′s disease. In silico proteolysis could be used to analyze the protein sequences of traditional Chinese medicine（TCM）. According to the combination of in silico proteolysis and PIN， the biological activity of oligopeptides could be interpreted rapidly based on the known TCM protein sequence. The study provides the methodology basis for rapidly and efficiently implementing the mechanism analysis of TCM oligopeptides.

[Key words] in silico proteolysis； Pinctada fucata； PIN； reverse target identification； pharmacophore； oligopeptidesendprint

珍珠母为珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pinctada fucata的贝壳，收录于《中国药典》2015年版，其味咸性寒，归肝、心经，具有平肝潜阳、安神定惊、明目退翳的功效[1]。作为我国的传统中药，珍珠母的临床应用始见于唐代陈藏器[2]的《本草拾遗》，“老蚌含珠，壳堪为粉。烂壳为粉，饮下，主反胃，心胸间痰饮”。可见珍珠母的应用形式常为珍珠母粉末。现代研究表明，珍珠母的有效成分不是占90%以上的碳酸钙，而是其中少量的有机酸及活性蛋白[3]。在用药过程中，珍珠母的活性蛋白可在肠道中经消化水解形成活性寡肽，从而被吸收入血，发挥药效。珍珠母寡肽具有较好的镇静、催眠、安神作用，多用于治疗神经类的疾病[4]。

本研究通过计算机辅助蛋白水解技术，模拟消化道的消化酶组成，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶共同虚拟水解[5]，获得包含2～6肽的珍珠母虚拟水解寡肽，构建虚拟结构数据库。随后利用反向找靶技术，获得珍珠母寡肽作用的潜在关键靶标。利用这些蛋白互作关系信息构建蛋白质相互作用网络（protein interaction network，PIN），对网络进行功能模块分析，以期从分子水平解析珍珠母寡肽治疗神经类疾病的作用机制，为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 珍珠母蛋白的模拟水解及寡肽数据库构建 本研究以马氏珍珠贝Pinctada fucata为检索词，通过在NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中对其所含的主要储存蛋白质进行检索。研究表明，珍珠母中所含蛋白质主要为马氏珍珠贝的珍珠层蛋白nacrein，N16与N19等[69]。

本研究收集其蛋白序列688條，其中包括有大量由于核苷酸多态性引起的多样性蛋白序列。本研究采用BIOPEP（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index. php/pl/biopep）对获得的蛋白序列进行计算机辅助模拟水解，以预测珍珠层蛋白序列的切割位点。实验采用模拟胃肠道消化水解的策略，选择胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶和糜蛋白酶作为消化酶共同虚拟水解。基于获得的切割位点进一步分解蛋白序列，选择其中2～6肽的分子并利用Discovery Studio 4.0（DS）进行寡肽三维结构数据库的构建[10]。

1.2 珍珠母寡肽的反向找靶研究 由于本文进行天然寡肽的模拟水解，因此选择天然立体构型的氨基酸来构建寡肽分子，即L型氨基酸，最后通过Minimize ligands对寡肽分子进行能量最小化分析，在CHARMm力场下加载MomanyRone电荷，采用最陡下降法和共轭梯度法相结合的能量优化算法，获得寡肽的最低能量构象。随后对寡肽分子进行多构象的生成，选择BEST模式，生成255个构象，从而生成珍珠母寡肽三维结构数据库。本研究基于DS软件中PharmaDB数据库的药效团模型，进行反向找靶研究[1112]。搜索方式选择柔性搜索，以匹配打分值0.9为截断值，计算每个靶标的打分值总和，从而评价珍珠母寡肽潜在的作用靶标，进一步构建其蛋白互作网络。

1.3 蛋白互作网络的构建 珍珠母寡肽的潜在作用靶标的蛋白质相互作用信息来源于String数据库（http：//stringdb.org/）[13]，包含已知的和预测的人源蛋白质相互作用信息。在String中，对每一个蛋白相互作用都有一个打分值，打分值越高，则数据越可靠，本文选取打分值大于0.9且排名前20的高置信度的PPI数据，以确保结果的可靠性。将获得的全部蛋白相互作用数据导入Cytoscape 3.4.0[14]软件，对每个靶点的蛋白互作网络进行union[15]计算，从而将独立的各个靶标的蛋白互作信息进行整合，去除孤立点、重复边和自环边，构建珍珠母寡肽的蛋白互作网络。

1.4 蛋白模块分析 蛋白质通过彼此之间相互作用结合成一个团体来完成其生物学功能，这些紧密联系的团体称之为蛋白复合体或功能模块。本研究采用基于复合检测算法（MCODE）[16]对蛋白网络进行模块分析。其中，决定识别模块大小的参数KCore设置为3，即至少包含4条边。并利用BinGO插件[17]对识别出的模块进行功能注释，其中显著性选择0.05，基因本位信息及注释信息均来自Gene Ontology （http：//www.geneontology.org/）。BinGO使用的统计检验方法为超几何检验，该检验方法用P表示一组基因属于同一基因本位的概率，P越小说明一组基因属于同一基因本位的概率越大。本研究对识别获得模块的注释结果进行模块功能的分析，有助于从系统角度理解各种生物学过程，解释珍珠母寡肽的作用机制。

2 结果与讨论

2.1 珍珠母寡肽库的构建 本研究对珍珠母珍珠层主要蛋白序列进行计算机水解预测，针对其中具有较好的相对分子质量与成药性的2～6肽构建了包含458条珍珠母水解寡肽的数据库。其中各段寡肽的数目分布见图1。

2.2 反向找靶 通过DS软件的Ligand Profiler功能对得到的珍珠母层蛋白与PharmaDB数据库的药效团模型进行反向找靶。以匹配打分值0.9为截断值，计算每个靶标的打分值总和。截取打分值总和排名前20的靶标进行进一步分析。关键靶点及对应的基因信息及打分值见表1。将筛选得到的关键靶点与珍珠母层蛋白进行相互匹配，得到珍珠母与药效团的匹配热度图2。横坐标代表20个药效团模型，纵坐标代表458个寡肽。不同色度变化表示相互作用不同，从蓝色到红色，表示珍珠母寡肽与靶标的相互作用逐渐增强。

2.3 珍珠母寡肽蛋白互作网络 本研究构建的珍珠母寡肽的蛋白互作网络见图3，包含251节点、1 112条边。基于MCODE方法对网络进行模块分析，共获得12个功能模块，见图4，其中，运用BinGO对模块进行注释，获得的主要生物过程见表2。endprint

2.4 蛋白模块分析 通过模块分析，珍珠母寡肽主要参与的生物过程有G蛋白偶联受体信号通路、对刺激的细胞应答、细胞有丝分裂周期间期、基于肾素血管紧张素的动脉血压调节、β淀粉样蛋白代谢通路等。其中，与神经系统直接相关的模块包括模块1和模块12，与心血管系统直接相关的模块包括模块1、模块2、模块3和模块8，与细胞迁移相关的模块包括模块9和模块10，与细胞应答相关的模块包括模块7和模块10。珍珠母具有平肝潜阳、安神定惊的传统功效[18]，与神经系统疾病相关。因此，本研究针对G蛋白偶聯受体信号通路模块1和β淀粉样蛋白代谢通路模块12，探讨珍珠母寡肽针对中枢神经类疾病的治疗作用。

核心靶点之一。5HT2A介导的G蛋白偶联受体信号通路在调节中枢神经系统的功能中具有重要作用[19]，其与人类多种精神活动密切相关，是治疗抑郁症、焦虑症、失眠等神经类疾病的关键靶点[20]。研究表明5HT2A与mGluR的活性高度相关，mGluR可以调节5HT2A的活性，从而共同调控机体对神经兴奋的反应[2122]。研究发现[23]，低浓度的NPS通过直接作用于5HT2A来选择性的抑制5HT的释放，从而影响机体在神经系统的活动。5HT2A水平降低导致的情志低迷对应的中医证型之一为心肾不交型，其症状多见情绪抑郁，心悸，健忘，失眠多梦，烦躁多汗等[24]。《灵枢经·邪客》云：“心者，五脏六腑之大主也，精神之所舍也”，可见人的意识、精神、思想活动与心关系密切。针对这种中医证型，珍珠母具有良好的治疗效果[25]。珍珠母归心经，具有安神定惊的传统功效，临床上珍珠母可用于治疗神经类疾病如惊悸怔忡、心神不宁、失眠健忘等。《本草纲目》[26]中记载珍珠母可“安魂魄，止遗精白浊，解痘疗毒”。结合本实验的研究结果，珍珠母寡肽可调节关键蛋白5HT2A的功能，提示珍珠母寡肽具有潜在的治疗惊悸失眠，心神不宁等神经类疾病的作用。

模块12代表的β淀粉样蛋白代谢通路，包括β分泌酶1（beta secretase 1，BACE1）、Nicastrin蛋白（nicastrin）和早老素1（presenilin1，PSEN1）等，与神经类疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）有密切关系。其中，BACE1是神经系统疾病的主要靶点之一，因其是生成β淀粉样蛋白（Aβ）过程中的关键限速酶。Aβ的沉积被认为是导致神经元伤害的重要原因。本实验发现，珍珠母寡肽可通过作用于BACE1发挥作用。BACE1敲除的小鼠不能产生Aβ，且小鼠生理及解剖学健康不受影响，因此BACE1是治疗神经类疾病AD的潜在重要靶标[27]。Nicastrin[28]和PSEN1[29]均为γ分泌酶的重要组成部分，而γ分泌酶能够促进Aβ的产生。因此，对Nicastrin和PSEN1功能的认识和了解可能为γ分泌酶及AD相关药物开发带来新的认识。AD在中医学中属于“呆病”，肝阳上亢型为AD的主要证型之一，症状多见烦躁易怒，头晕健忘等。针对这种AD的证型，平肝潜阳法为其主要治法[30]。珍珠母归肝经，具有平肝潜阳，重镇安神之功效。《饮片新参》[31]中记载珍珠母可“平肝潜阳，安神魂，定惊痫。”《中国医学大辞典》中记载珍珠母“入肝经，可滋肝阴，清肝火，治癫狂惊痫，头眩等”。结合本实验研究，进一步发现珍珠母寡肽可调节关键蛋白BACE1发挥作用，从而发挥调节中枢神经系统类疾病如AD的药效，有助于部分揭示珍珠母寡肽的作用机制。

3 结论

本研究基于计算机辅助水解方法，对珍珠母中的蛋白质进行模拟消化水解，获得并构建了包含458个珍珠母寡肽三维结构数据库。随后，利用反向找靶技术，对珍珠母寡肽作用的前20个作用靶标进行网络富集及蛋白相互作用的分析，发现了12个功能模块。这些功能模块与神经系统、心血管系统、细胞迁移与应答等有关。其中，5HT2A介导的G蛋白偶联受体信号通路模块和β淀粉样蛋白代谢通路模块与神经系统直接相关。模块中的珍珠母寡肽作用的关键蛋白如5HT2A和BACE1等可以调节神经内分泌、抑郁、镇静、焦虑以及AD等疾病的过程，提示珍珠母寡肽能够治疗失眠、焦虑、AD等疾病。对于本文的研究结果，还需要进一步分析珍珠母寡肽是否能吸收入血，同时寡肽化合物活性需要进行生物实验验证。本文通过联合计算机辅助水解技术和蛋白互作网络方法，阐释珍珠母寡肽治疗中枢神经类疾病的作用机制。同时也为探讨快速、高效开展中药来源的肽类物质的活性机制研究提供了方法学依据。

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[责任编辑 张宁宁]endprint