不同茶类寡肽含量的测定和分析

2022-02-03刘慧王小娟王弛刘华丰翁秋生叶乃兴谢勇赵峰

南方农业学报 2022年10期

刘慧，王小娟，王弛，刘华丰，翁秋生，叶乃兴，谢勇，赵峰*

（1福建中医药大学药学院，福建福州 350122；2福建省产品质量检验研究院，福建福州 350025；3福建农林大学园艺学院，福建福州 350002；4闽江师范高等专科学校，福建福州 350109）

0 引言

【研究意义】寡肽是一种小分子多肽，因其功效特殊，能通过被动扩散等作用被小肠上皮细胞吸收（王宁和令狐恩强，2018），在近年的食品科学研究中广受关注。相关研究显示，当一系列特殊的氨基酸序列存在于大分子蛋白中时，因活性中心被包埋，通常不表现活性，但其以寡肽形式存在时，活性中心暴露后会显现出特殊活性，如免疫调节（何丽霞等，2015）、降血糖（孙彬等，2016）、降血脂（李迪等，2017）、抗氧化（任金威等，2017）等功效。此外，寡肽对食品的风味品质有重要贡献，乳蛋白水解后产生的各种肽对其甜味、苦味和酸味均有影响（王永强等，2008）；大豆蛋白经微生物发酵后，产生的大豆肽风味独特（刘新旗等，2020）；畜肉解僵期的蛋白质降解会改善肉品的滋味（窦露等，2020）。对食品肽的系统研究已为新型食品添加剂或功能性食品研发提供了诸多关键理论支持，有力促进传统食品产业的升级，成为食品科学的重要发展方向之一（Ayim et al.，2018；Liu et al.，2021）。茶是风靡全球的饮品，不但风味极佳，而且保健功效突出。建立一种茶叶寡肽定量分析方法，分析不同茶类寡肽含量的差异，对茶叶寡肽的相关研究和利用具有重要意义。【前人研究进展】茶叶中的含氮化合物占干重的20.00%~30.00%，其存在形式包括游离氨基酸、水溶性蛋白质和水不溶性蛋白质（顾谦等，2002；于鹏亮，2013）。茶叶中水溶性蛋白质由少量水溶性大分子量蛋白质和大量寡肽构成（罗钦等，2012）。目前，茶叶水溶性蛋白质的主要定量方法是考马斯亮蓝法，但G250染色剂对茶叶寡肽的显色效果不佳（陈蓉等，2015）。其他常见的水溶性蛋白质测定方法有福林酚法和双缩脲法（张贤忠等，2013；卫国等，2016；张玲等，2019），但这些方法通常会受到茶叶中酚类物质的干扰，也无法实现茶叶寡肽定量。目前关于寡肽定量方法的报道较少，大多以双缩脲法和福林酚法检测食品或药物中多肽含量（卫国等，2016；张玲等，2019），但此类方法不适用于寡肽。目前关于寡肽的定量研究方法，罗钦等（2008，2012）利用甲醛滴定法和凯氏定氮法检测鱼粉中寡肽含量，并建立相应的标准，为茶叶寡肽的定量分析提供了研究思路。【本研究切入点】本课题组前期研究已从白茶中发现了一系列具体寡肽（Zhao et al.，2019），并通过超高分辨液质联用等大型分析设备构建了茶叶寡肽的高通量测序方法（Zhao et al.，2022），但关于茶叶寡肽定量分析方法的建立尚未见相关报道。本研究立足于常规理化实验室硬件条件，根据食品寡肽测定的基本原理（曾哲灵等，2012），从提取液的水溶性蛋白质组成切入，先以沉淀剂去除大分子量蛋白质，再以凯氏定氮法测定其上清液的总氮（即游离氨基酸和寡肽总量），最后减去通过甲醛滴定法测得的上清液中游离氨基酸含量，即得寡肽含量，构建简便可行的茶叶寡肽定量方法。【拟解决的关键问题】三氯乙酸沉淀大分子量蛋白、甲醛滴定法测定游离氨基酸总量和凯氏定氮法测定总氮均为经典且成熟的理化分析方法，本研究将上述方法按照食品寡肽测定的基本原则设计试验，并通过单因素试验优化提取条件；同时，通过一定数量样本实测，检测其可靠性和实用性，以期构建适用于普通理化实验室操作、简便可行的茶叶寡肽定量方法，为茶叶寡肽研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶类包括黑茶、白茶、绿茶、红茶、黄茶和乌龙茶共六大类，30份样品，具体信息见表1。无水乙醇、三氯乙酸、氢氧化钠、浓硫酸、盐酸和甲醛均为分析纯，购自国药集团化学试剂上海有限公司。主要仪器设备：SH420F石墨消解仪、K9840自动凯氏定氮仪（山东海能科学仪器有限公司）；PHS-3Eph计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；HH-6S恒温水浴锅［拓赫机电科技（上海）有限公司］；DL-4000C冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

表1 样品信息Table 1 Sample information

1.2 试验方法

1.2.1 混合样制备30份参试样品各取10 g，混合粉碎后，以四分法缩分制备代表性样，用于方法优化试验。

1.2.2 样液提取及前处理.称取2.500 g粉碎样置于锥形瓶，加入50 mL 50%（v/v）乙醇水溶液摇匀，接回流冷凝管后，置于80℃水浴锅提取30 min，冷却并重新定容至50 mL。

1.2.3 提取条件单因素试验.分别称取2.500 g样品置于锥形瓶，加入50 mL提取溶剂并摇匀后，置于水浴锅中，接回流冷凝管。

具体试验组合设计：80℃水浴条件下，以不同浓度的提取溶剂（水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和100%乙醇），分别提取30 min；以50%乙醇作提取溶剂，在不同水浴温度（60、70、80、90和100℃）下，分别提取30 min；以50%乙醇作提取溶剂，在80℃水浴条件下，分别提取不同时间（20、30、40、50和60 min）。

1.2.4 寡肽含量测定.提取液冷却后，以对应溶剂定容至50 mL，摇匀，移取20 mL溶液2份，分别加入20 mL 15%（m/v）三氯乙酸，摇匀，4℃静置30 min后，离心取上清液。分别准确移取20 mL溶液2份，一份以凯氏定氮法测定寡肽和游离氨基酸总量，另一份以甲醛滴定法测定游离氨基酸含量。

寡肽和游离氨基酸总量：向提取液中加入20 mL 15%三氯乙酸溶液，混合并静置5 min，4000 r/min离心5 min，过滤，根据GB/T 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法操作，消解并测定蛋白质含量。

式中，T为寡肽和游离氨基酸总量（%），C为HCl标准溶液浓度（mol/L），V为HCl标准溶液消耗体积（mL），V0为滴定空白体积（mL），m为折算后样品质量（g），6.25为蛋白质换算系数。

游离氨基酸含量：向提取液中加入60 mL纯净水，按照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的甲醛滴定法进行操作，以NaOH溶液调节样液pH至8.20后，加10 mL中性甲醛溶液，1 min后再以0.1 mo/L NaOH标准溶液滴定样液pH 9.20，记录标准溶液消耗量，计算游离氨基酸含量。

式中，A为游离氨基酸含量（%），C为NaOH标准溶液浓度（mol/L），V为NaOH标准溶液消耗体积（mL），V0为滴定空白体积（mL），m为折算后样品质量（g），7为氨基酸转换系数。

寡肽含量计算：寡肽含量=寡肽和游离氨基酸总量-游离氨基酸含量，即：G（%）=T-A。

1.2.5 稳定性试验.按照优化后的提取方法，平行称取6份样品，试验后计算结果相对标准偏差（RSD），评估方法的稳定性。

1.2.6 总蛋白质含量.称取0.20 g样品置于消化管中，按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测得总蛋白质含量。

1.3 统计分析

采用Office 2016和SPSS 22.0对试验数据进行统计分析、差异显著性检验及制图。

2 结果与分析

2.1 溶剂浓度对茶叶中寡肽含量的影响

由图1可知，从寡肽和游离氨基酸总量（T）及游离氨基酸含量（A）的提取结果来看，随着提取溶剂中乙醇占比的增加，二者均呈先升高后下降的变化趋势，即以50%乙醇作提取溶剂时，提取含量均达峰值，寡肽和游离氨基酸总量为8.07%，游离氨基酸含量为4.02%，与提取溶剂为水和无水乙醇（100%乙醇）时的含量相比，均存在显著差异（P＜0.05，下同）。

图1 不同浓度提取溶剂对寡肽含量的影响Fig.1 Effects of extraction solvents of different concentrations on oligopeptide content

寡肽含量的变化趋势虽然与寡肽和游离氨基酸总量、游离氨基酸含量相似，但提取溶剂为水、25%乙醇和50%乙醇时，增长趋势并不明显，当乙醇比例继续增加，寡肽含量开始下降。综合寡肽和游离氨基酸总量与游离氨基酸含量的结果，当以水和25%乙醇为提取溶剂时，寡肽和游离氨基酸总量与游离氨基酸含量的提取尚不充分，尤其是游离氨基酸含量的溶出率低，由此导致寡肽含量结果略高。

进行溶剂优化的最终目的是确保目标物质（T和A）的提取效率最高。当以50%乙醇为提取溶剂时，寡肽和游离氨基酸总量与游离氨基酸含量均达最大值，考虑到二者的变化趋势基本一致，故认为此时对应的寡肽含量更可靠，因此选择50%乙醇作为提取溶剂，此时寡肽含量为4.05%。

2.2 提取温度对茶叶中寡肽含量的影响

由图2可知，提取温度对寡肽和游离氨基酸总量无显著影响（P＞0.05，下同），总量在8.02%~8.49%；游离氨基酸含量则在60、70、80和100℃间无显著差异，含量在3.81%~4.37%，提取温度为90℃时，游离氨基酸含量达峰值，与60和70℃的游离氨基酸含量间无显著差异，但与80和100℃存在显著差异；寡肽含量在60~90℃无显著差异，含量在3.71%~4.46%，呈先升后降的变化趋势，其中80℃时寡肽含量最高；100℃时寡肽含量突然上升，是由于100℃时游离氨基酸含量低，导致寡肽含量相对较高。

图2 不同提取温度对寡肽含量的影响Fig.2 Effects of different extraction temperatures on the content of oligopeptide

综上结果，70和80℃均为可行的提取温度条件，以寡肽含量为判断标准，选择寡肽含量高的温度条件，确定以80℃为优化后提取温度。

2.3 提取时间对茶叶中寡肽含量的影响

如图3所示，在20~50 min范围时，寡肽和游离氨基酸总量、游离氨基酸含量及寡肽含量均呈先升后降的变化趋势，提取时间为60 min时，三者含量又有所上升。提取时间对寡肽和游离氨基酸总量、游离氨基酸含量及寡肽含量均无显著影响，其中寡肽含量在3.71%~4.68%；提取时间为30和40 min时，寡肽含量分别为4.43%和4.42%，二者相差小，在时间因素对寡肽含量无显著影响的情况下，选择30 min为优化后的提取时间，保证提取效率的同时，缩短提取时间。

图3 不同提取时间对寡肽含量的影响Fig.3 Effects of different extraction times on oligopeptide content

2.4 方法稳定性结果

本研究中寡肽为多种寡肽混合物，结构复杂，因此仅考虑重复性试验，验证其稳定性。结果（表2）显示，重复试验的RSD均小于5.00%，寡肽含量测定方法的稳定性良好。

表2 方法稳定性结果Table 2 Stability test result of method

2.5 各茶类寡肽含量测定结果

按照最终确定的样品提取及测定方法，对六大茶类样品（共30份）进行测定，结果如表3所示；按照其所属茶类，进行描述统计分析（表4）。从总蛋白质含量、寡肽和游离氨基酸总量、游离氨基酸含量及寡肽含量测定结果来看，不同茶类、不同品种茶之间的变化趋势基本一致，总蛋白质含量高的茶叶，其寡肽含量也高。不同品种乌龙茶的总蛋白质含量为17.82%~28.87%，其中大红袍的总蛋白质含量最高，其寡肽含量也最高（3.93%），铁观音的寡肽含量最低，仅有0.70%；乌龙茶的总蛋白质和寡肽含量均值在六大茶类中均为最低。不同品种红茶中总蛋白质含量为22.29%~27.55%，红茶1的总蛋白质含量最低，寡肽含量也最低，为1.90%，红茶2的总蛋白质含量最高，寡肽含量也最高，为4.84%，是红茶1寡肽含量的2.5倍。不同品种白茶的总蛋白质含量为26.00%~36.15%，寡肽含量为3.88%~6.00%，牡丹皇寡肽含量是白牡丹寡肽含量的1.5倍。不同品种黑茶中总蛋白质含量为24.33%~30.55%，寡肽含量为3.11%~6.53%，其中六堡茶和普洱熟茶的寡肽含量分别为6.53%和5.42%，明显高于其他品种黑茶，六堡茶的总蛋白质含量最高，普洱熟茶的总蛋白质含量（26.10%）较高；虽然黑毛茶1总蛋白质含量较低，但其游离氨基酸和寡肽总量及游离氨基酸含量均最高。不同品种绿茶中总蛋白质含量为23.98%~33.95%，其中云雾康花茶的总蛋白质含量最低，其寡肽含量也仅有2.45%，约为茉莉花茶寡肽含量的二分之一。六大茶类中，黄茶的总蛋白质含量最高，为30.79%~38.11%，寡肽含量为4.73%~5.76%，均值分别为33.64%和5.31%，且各品种黄茶之间的总蛋白质含量、游离氨基酸和寡肽总量、游离氨基酸含量及寡肽含量差异小。

表3 参试样品总蛋白质含量、寡肽和游离氨基酸总量（T）、游离氨基酸含量（A）及寡肽含量（G）的测定结果（%）Table 3 Determination results of total protein content，oligopeptide and free amino acid content（T），total free amino acid content（A）and oligopeptide content（G）in tested samples（%）

表4 各茶类样品总蛋白质含量、寡肽和游离氨基酸总量（T）、游离氨基酸含量（A）及寡肽含量（G）的统计结果（均值±偏差）（%）Table 4 Statistical results of total protein content，oligopeptide and free amino acid content（T），total free amino acid content（A）and oligopeptide content（G）of different teas（mean±SD）（%）

各茶类有其相应的鲜叶采摘标准，一般而言，鲜叶原料嫩度高的茶，其总蛋白质和游离氨基酸含量高于粗老原料加工的茶（李兵等，2019）。由表3和表4可知，参试样品的总蛋白质和游离氨基酸含量大致分为两类：一类是黄茶、白茶和绿茶，其原料嫩度高，总蛋白质平均含量为30.85%~33.64%，游离氨基酸平均含量为5.00%~6.22%；另一类是乌龙茶、红茶和黑茶，其原料相对较粗老，故总蛋白质和游离氨基酸含量均稍低，分别为21.16%~26.81%和2.83%~4.57%。寡肽含量测定结果显示，黄茶和白茶相对较高，可达5.31%和5.20%；其次为黑茶和绿茶，分别为4.42%和4.28%；红茶和乌龙茶较低，分别为3.31%和2.24%。

3 讨论

3.1 茶叶寡肽提取方式

通过单因素试验，分别证实提取溶剂、提取温度和提取时间对茶叶中寡肽含量的影响。由于寡肽含量为寡肽和游离氨基酸总量与游离氨基酸含量的差值，在单因素试验中，需综合考虑这2个指标的含量。

乙醇和水是常用的中药材提取溶剂，主要用于提取极性物质。随着乙醇比例的增加，游离氨基酸含量、寡肽和游离氨基酸总量及寡肽含量均呈先升后降的变化趋势，在提取溶剂为50%乙醇时，3种物质含量均达最大值，因此选择50%乙醇作为最优提取溶剂，但提取溶剂为25%、50%和75%乙醇时，寡肽和游离氨基酸总量及游离氨基酸含量均无显著差异。提取温度对游离氨基酸和寡肽总量无显著影响，提取温度为80℃时，寡肽含量高，但提取温度为60~90℃时，寡肽含量均无显著差异。乙醇的沸点是78.4℃，提取温度为60和70℃时，未达到乙醇的沸点，无法达到回流条件，游离氨基酸和寡肽不能完全溶出。提取时间对于寡肽和游离氨基酸的提取无显著影响，因此在选择提取时间时，从提取效率考虑，选择30 min为宜。

寡肽含量是将提取液中测得的游离氨基酸和寡肽总量减去游离氨基酸含量所得。在试验中发现，提取溶剂种类对游离氨基酸和寡肽总量及游离氨基酸含量存在明显且不同的影响趋势，但由于寡肽含量是二者相减的结果，从实际的计算结果来看，除提取溶剂种类外，提取温度和提取时间并未对寡肽含量造成明显影响。分析其原因，可能是由于试验所采用的热回流提取方法中回流提取温度较高，已能确保茶叶寡肽的充分溶出，故而认为没有必要进一步开展正交试验。

3.2 茶叶游离氨基酸测定方法

目前常见的氨基酸定量分析方法有茚三酮显色法、甲醛滴定法和AQC柱前衍生法。由于寡肽的化学性质与游离氨基酸较为接近，存在暴露的氨基端和羧基端，因此也具备两性电解质特征，还原性茚三酮除了与氨基酸的氨基端反应生成紫色化合物，还会与寡肽暴露的氨基端发生反应。AQC柱前衍生法是目前公认的较准确可靠的游离氨基酸测定方法，需通过各具体氨基酸标准品，配合柱前或柱后衍生处理后，借助自动氨基酸分析仪、色谱质谱联用仪等大型分析系统开展（陈思肜等，2019；Zhou et al.，2019），操作方法较复杂。本研究采用甲醛滴定法测定游离氨基酸，该方法最大的优点在于简便易行，不需要色谱质谱等大型仪器即可完成，其利用氨基酸两性电解质的特性，常温下，过量甲醛可迅速与氨基酸的氨基端结合生成羟甲基化合物，导致反应平衡右移，使溶液的酸度增加，通过碱滴定即可计算游离氨基酸含量（王斯维等，2019）。对于甲醛滴定法、茚三酮和色谱法测得的游离氨基酸含量间是否存在差异，需进一步探究。

3.3 茶叶寡肽研究

一直以来，茶叶化学对茶汤中水溶性蛋白质作用的认识较模糊，仅一般性地认为其与滋味的醇厚度密切相关。本团队在前期研究中通过高分辨质谱技术，对白茶加工过程中的寡肽变化进行了较系统研究（Zhao et al.，2019），证实了茶叶中寡肽的存在。通过本研究构建的茶叶寡肽含量测定理化方法，测得茶叶中寡肽含量为3.00%~5.00%，该结果说明除大分子水溶性蛋白质外，寡肽也是茶叶中水溶性肽的重要存在形式。

茶叶中的寡肽含量不低，但之前未被重视。一方面是以往多通过考马斯亮蓝显色法测定茶叶的水溶性蛋白质总量，而考马斯蓝G-250虽然能很好地与大分子水溶性蛋白质络合显色，但对低分子量寡肽的结合能力差，无法通过紫外光谱法直接测定寡肽含量；另一方面，寡肽含量虽不低，但种类繁多，化学性质接近，单一寡肽的绝对含量有限，尤其是其极性接近游离氨基酸，而传统的研究手段需通过分离制备获取纯品后才能开展后续工作，极大地制约了寡肽研究。但当前食品滋味肽和生物活性肽的发展极其迅速，对茶叶肽开展系统性研究，将有助于从全新的角度探究茶叶保健功效和风味品质构成机理。

对于不同茶类中寡肽的含量变化，以粗老原料加工的黑茶，其寡肽含量接近鲜嫩原料加工的绿茶。说明除了原料的嫩度，加工工艺会对茶叶的寡肽有明显影响。虽然原料粗老的黑茶总蛋白质含量和游离氨基酸含量不高，但寡肽含量较高，可能是后发酵过程中，由于外源微生物的作用，茶叶中原有的非水溶性大分子蛋白质被降解为水溶性较好的小分子肽段。该结果可为黑茶的保健功效研究提供全新思路。

乌龙茶的寡肽含量最低，推测除了受原料嫩度的影响，乌龙茶的焙火工艺也会造成其寡肽含量偏低。焙火是乌龙茶精制中的重要工序，在该过程中，茶叶中所含氨基酸类与还原糖类物质加温后会发生美拉德反应，赋予乌龙茶特殊的风味（江山等，2012；王丽等，2020）。从化学性质上看，寡肽的化学性质与氨基酸接近，因此，经焙火后，寡肽与氨基酸一样，也会与还原糖类物质发生反应生成风味物质，由此导致其含量下降。之前由于茶叶中寡肽含量和具体种类尚不明确，故未见关于茶叶寡肽及其相关美拉德反应生成物对茶叶品质影响的报道，本研究结果可为乌龙茶风味品质形成的相关研究提供新的切入点。

本研究所使用的红茶是按照传统采摘标准及加工工艺而制备的样品，故其鲜叶为达到一定成熟度的原料，其游离氨基酸含量和寡肽含量不低，说明在红茶的加工过程中，茶叶原有的内源酶极可能参与大分子蛋白质的降解过程。目前的数据虽然尚不充分，但可为红茶加工过程的大分子蛋白质降解及其对风味品质的作用研究提供参考。

本研究结果显示，白茶、黄茶和绿茶的寡肽含量均较高且较接近。从原料角度分析，这三类茶对原料嫩度的要求较接近。目前难以推断萎凋、闷黄、炒青等工艺对寡肽含量的具体影响趋势，下一步可有针对性地开展研究。