基于Fe3+-多巴胺修饰Pluronic的多功能性水凝胶制备

黄葵，肖旺钏，苏志忠，何旺龙，黄志强，王龙江

(三明学院资源与化工学院，福建三明365004）

基于Fe3+-多巴胺修饰Pluronic的多功能性水凝胶制备

黄葵，肖旺钏，苏志忠，何旺龙，黄志强，王龙江

(三明学院资源与化工学院，福建三明365004）

利用对硝基苯基氯酸甲酯作为聚合物Pluronic F127端羟基活化剂，与盐酸多巴胺直接反应制备末端多巴胺修饰的Pluronic F127（PluF127－DOPA）。核磁共振氢谱和紫外－可见分光光度技术显示多巴胺与Pluronic F127的偶联率高达98．0%。在一定PluF127－DOPA聚合物浓度（≧13%（wt/v），多巴胺基团∶Fe3+的摩尔比为3∶1）和温度下，随着pH值增大（3．5～12），多巴胺基团与金属Fe3+发生从一配位到稳定三配位结构的转变，引起Pluronic聚合物交联生成水凝胶（PluF127－DOPA－Fe3+）。该新型水凝胶具有pH响应性和自我修复等多功能特性。动态流变学技术表明PluF127－DOPA－Fe3+凝胶断裂后，储能模量在1～2 Min内恢复到断裂前的数值，在生物医学和水下机械涂层等方面具有实际意义。

多巴胺；Pluronic；Fe3+配位；pH响应性；自愈性；水凝胶

智能水凝胶具有对环境刺激具有外场响应的特性，其形貌和性能可以随外界环境如pH值、温度、光以及化学物质等条件的变化而改变,在生物医学工程和工、农业等领域具有广泛的应用[1-2]。根据水凝胶网络键合的不同，可分为物理凝胶和化学凝胶。化学凝胶虽然有良好稳定性，但可注射性和自我修复性较差；而通过非共价键形成的物理凝胶通常不稳定且机械性能较差[3]。因此，设计既具有物理凝胶的刺激响应性，同时拥有化学凝胶稳定性的新型多功能性材料是智能水凝胶研究领域的一个重要目标。本文受海洋贻贝在水下超强黏附机理的启发，利用金属配位相互作用制备一种基于Pluronic聚合物的具有pH响应性和自愈性等多功能性材料。

海洋贻贝分泌超强黏液到轮船底部或礁石表面，该蛋白黏液能迅速交联、固化形成足丝，即使在巨浪的冲刷下仍能紧紧地附着底材。研究发现，提取出的几种贻贝黏附蛋白中含有一种酪氨酸转议后产物-3,4-二羟基苯丙氨酸（Dopa，又称多巴）[4]。人们普遍认为多巴是造成贻贝黏附蛋白具有高黏性和高韧性的主要原因。Waite等还发现贻贝足丝表皮中含有大量的无机成分，例如金属Fe3+，多巴残基儿茶酚与Fe3+进行配位作用，随着环境pH增大，发生一配位、二配位到稳定三配位结构的转变，引起黏附蛋白间的交联、固化，形成具有延展性和自愈性的贻贝足丝外皮[5-6]。其中，多巴残基儿茶酚与Fe3+的二配位和三配位结构的稳定常数是已知金属配合物中最高的，较共价作用弱又比氢键强。虽然金属配位相互作用已成为用于交联、强化高分子机械性能的新兴方法，但很少有利用多巴基团和金属离子之间的配位作用制备新型多功能性水凝胶。Andersen等利用pH诱导金属与多巴配位原理，制备了基于四臂聚乙二醇的水凝胶[7]。

Pluronic聚合物,又称聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇（PEO-PPO-PEO），具有生物相容性、温敏性且价格便宜，是被美国批准的可以直接或间接用作药物、食品和农业产品等添加剂的嵌段共聚物，其中Pluronic F127是近年来研究的主要给药载体之一[8]。该材料在水溶液中表现出很强的浓度和温度依赖的自组装行为，具有反向热敏胶凝性质。但作为物理性水凝胶，Pluronis水凝胶机械性能较差，导致在生理条件下药物快速释放[9]。本文研究利用pH诱导Fe3+与多巴配位作用，制备新型多功能性Pluornic水凝胶。

1实验部分

1.1主要材料和仪器

Pluronic F127由美国Sigma-Aldrich公司生产；98﹪盐酸多巴胺（DOPA）、99﹪左旋多巴等由阿拉丁试剂(上海)有限公司生产；98%的对硝基苯基氯酸甲酯由百灵威科技有限公司生产等。Pluronic F127和三乙胺使用前重新干燥。联合碳化渗析袋（分子截留3500）（佰易聚生物商城）；日本EYELA全自动旋转蒸发仪N-2100；DZF-6053型真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；岛津UVmini-1240型紫外-可见分光光度计；美国Varian INOVA 500 MHz核磁共振谱仪；美国SpectruMSoilstik pH计；德国Anton Parr高级MCR-302流变仪等。

1.2多巴胺修饰Pluronic F127（PluF127-DOPA）的合成

如图1，PluF127-DOPA的合成由两步反应完成。第一步活化Pluronic F127端羟基，制备对硝基-苯基氯酸甲酯修饰的Pluronic F127（PluF127-p-NPC）。10.00 g Pluronic F127溶解在60 mL二氯甲烷溶液中，加入245.5μL三乙胺。磁力搅拌和氮气保护下，该混合液逐滴加入溶解有0.9675 g对硝基苯基氯酸甲酯的10 mL二氯甲烷中。20 min滴加完毕，混合溶液在室温搅拌48 h。反应结束后，用饱和NaCl溶液萃取一次，有机相用无水硫酸钠干燥30 min。抽滤，浓缩。将浓缩液滴到冷无水乙醚中，得白色沉淀。过滤，真空干燥。重复上述滴定沉淀两次，得到纯化的PluF127-p-NPC，产率为88.6%。Pluronic端羟基活化程度通过分光光度法测定[10],p-NPC偶联率接近100%。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ,ppM0.96～1.40(br,-OCHC H3CH2O-),3.25～3.80(br,-OC H2C H2O-，-OC H CH3CH2O-), 4.42(m,-OCH2C H2OCOOC6H4NO2),7.37～8.25（2d，-OCH2CH2OCOOC6H4NO2）。

第二步是PluF127-p-NPC与盐酸多巴胺(DOPA)直接反应制备PluF127-DOPA。0.2945 g盐酸多巴胺加入到50 mL圆底烧瓶中，再加入4 mL N,N-二甲基甲酰胺。N2保护下搅拌，待盐酸多巴胺溶解后，加入324.0μL的三乙胺。反应20 min后，经恒压滴液漏斗逐滴加入溶解有2.0025 g PluF127-p-NPC的12mL氯仿。反应48 h，真空抽滤，浓缩滤液。将浓缩液滴入到冷的乙醚中，产生大量白色沉淀。抽滤，得白色固体。将干燥后的样品用0.01 mol/L HCl溶解后，装入分子截留量为3500的透析袋，在0.0001 mol/L HCl溶液中透析。48 h后，浓缩干燥，得纯净PluF127-DOPA产品，产率为93.6%。利用Waite和Benedict比色方法[11]测定多巴胺与Pluronic F127偶联率，采用左旋多巴作为标样，得97.3%的Pluronic F127与多巴胺偶联率。1H NMR(500 MHz,CDCl3)：δ,0.96～1.40(br,-OCHC H3CH2O-),2.62(t,-NHCH2C H2C6H3(OH)2),3.25～3.80(br,-OC H2C H2O-，-OC H CH3C H2O-),4.25 (m,-OCH2C H2OCOOC6H4NO2),4.99(d,-N H CH2CH2C6H3(OH)2),6.51～6.78(1 s,2 d,-OCH2CH2OCONHCH2CH2C6H3(OH)2)。

图1 PluF127-DOPA的合成路线

1.3 PluF127-DOPA与Fe3+混合稀溶液的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱测定

测定PluF127-DOPA与Fe3+混合稀溶液（DOPA∶Fe3+的摩尔比控制在3∶1）在不同pH的UV-Vis吸收光谱谱图。室温下，10 mg/mL的PluF127-DOPA（1.55 M Mol DOPA）溶解在去离子水中，按化学计量比（DOPA∶Fe3+=3∶1）加入0.139 mg/mL（0.52M Mol）FeCl3，加入NaOH调节溶液的pH值。

1.4 pH诱导PluF127-DOPA与Fe3+配位交联制备PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶

一定温度（约20℃）和pH诱导下，典型的400μL不同浓度的PluF127-DOPA与Fe3+配位形成水凝胶按如下步骤配制：1）溶解一定量PluF127-DOPA到200μL去离子水中；2）向上述PluF127-DOPA溶液中按DOPA∶Fe3+=3∶1比例，加入定量FeCl3溶液；3)调节加入NaOH溶液的量达到预期的pH。总的溶液体积是400μL；4）搅拌下，PluF127-DOPA与Fe3+发生配位，生成具有不同颜色和状态的PluF127-DOPA-Fe3+溶液或水凝胶。

1.5动态流变学测量

流变学实验采取平行双板装置以及震荡模式进行。在pH调控成胶实验中，温度设置为20℃，剪切形变为1%，频率为1 Hz，测量储能模量(G')和损耗模量(G'')在不同pH随时间的变化。在自修复实验测量中，采用频率1 Hz，剪切形变范围为1%～1000%，凝胶断裂后，剪切形变又设置为1%。

2结果与讨论

2.1 PluF127-p-NPC和PluF127-DOPA结构分析

图2是活化中间产物PluF127-p-NPC和最终产物PluF127-DOPA的核磁共振氢谱（1H NMR）叠加图。比较PluF127-p-NPC氢谱（图2（a））和PluF127-DOPA氢谱（图2（b）），明显不同是苯基氢化学位移发生了较大偏移。图2（a）中，对硝基苯基上两组H的位移都在7.0以上；与多巴胺偶联后，图2（b）显示多巴胺苯环上3组H的位移全部移到7.0以下，说明第二步PluF127-p-NPC与多巴胺的-NH2直接反应很完全彻底。同时，图2（b）在4.99处，观察到一新的小峰，归为新生成的-OCONH-中的酰胺氢。从1H NMR谱图积分面积计算得出，DOPA与Pluronic F127偶联率高达98.5%，与比色法得到的97.3%值接近。

图2核磁共振氢谱图

2.2 pH诱导下PluF127-DOPA-Fe3+交联水凝胶的制备

多巴的儿茶酚基团与Fe3+存在着可以通过酸碱变化调控的配位作用。随着pH增大，发生从一配位DOPA-Fe3+、二配位(DOPA)2-Fe3+到稳定三配位(DOPA)3-Fe3+的转变，这些配位结构可充当体系交联点应用于水凝胶的制备。图3（a）是约20℃时，浓度为15%(wt/v)的PluF127-DOPA溶液与Fe3+在不同pH时的颜色和状态，其中DOPA∶Fe3+摩尔比为3∶1。在pH=3.5时，PluF127-DOPA与Fe3+混合液呈绿色溶液；当pH=8时，溶液转变成紫色黏液；当pH调到12时，搅拌下溶液迅速生成具有高粘性和高弹性的深红色水凝胶，机械性能明显增强。同时，该凝胶具有可逆的pH响应性，当pH调到pH<5时，复又转变成可流动绿色液体，这主要是利用了在不同pH时，多巴残基儿茶酚与Fe3+不同的配位方式。在酸性(pH=3.5)或弱碱性(pH=8.0)条件下，DOPA与Fe3+主要以单DOPA或（DOPA）2形式与Fe3+进行配位，不足以使PluF127-DOPA发生交联形成水凝胶；但在强碱性(pH=12)条件下，DOPA与Fe3+主要以（DOPA）3-Fe3+进行配位，作为体系交联点，引起PluF127-DOPA高分子之间的交联而形成水凝胶。

图3约20℃时，PluF127-DOPA+交联凝胶（PluF127-DOPA：15%(wt/v)）在不同pH时的颜色和状态

图4是PluF127-DOPA稀溶液与Fe3+混合后在不同pH分别为3.5、8.0和11.0时的紫外-可见光谱图（UV-Vis），其中多巴胺∶Fe3+的摩尔比控制在3∶1，可以观察到PluF127-DOPA与Fe3+的配位情况。酸性条件下，溶液是绿色的，在770 nm左右处可以观察到一弱的宽吸收峰，归为单配位DOPA-Fe3+结构的特征吸收峰；在中性和弱碱性条件下，溶液是蓝色的，最大吸收峰移至575 nm，归结于二配位（DOPA）2-Fe3+结构的特征吸收峰；在强碱性条件下，溶液是红色的，主要吸收峰移至492 nm，归于三配位（DOPA）3-Fe3+结构的特征吸收峰[7]。其中三配位（DOPA）3-Fe3+结构的形成是引起Pluronic F127之间发生交联的主要原因。

图4 PluF127-DOPA-Fe3+稀溶液在不同pH的紫外-可见光谱图

动态流变学实验研究了PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶体系的力学性能。图5是20℃时，PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶（PluF127-DOPA浓度为15 wt/v%）在pH调控下，储能模量和损耗模量(G',G")随时间的变化。在pH=3.5时，体系的储能模量G'和损耗能量G"接近于0，Fe3+与单DOPA配位，不能引起聚合物之间发生交联，呈溶液状态；当溶液pH值调节到12时，体现出水凝胶形成的特征，反映体系弹性的储能模量G'以及粘性的损耗能量G"迅速增加，并且储能模量G'高于损耗能量G"，数值上G'逐渐接近于4.0 kPa，显示在pH=12时PluF127-DOPA与Fe3+配位后，能迅速引起Pluronic聚合物间的交联形成具有粘弹性的PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶。

图5 PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶在pH调控下储能模量和损耗模量(G',G")随时间的变化

表1是在～20℃时，不同浓度的PluF127-DOPA溶液在pH=12时，与Fe3+络合形成水凝胶的情况，其中DOPA∶Fe3+摩尔比控制在3∶1。结果显示，当PluF127-DOPA-Fe3+的浓度等于或高于13 wt/v%时，均可形成不同机械性能的深红色PluF127-DOPA-Fe3+交联水凝胶，低于13 wt/v%的PluF127-DOPA溶液不能生成PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶。

表1 20℃时，不同浓度的PluF127-DOPA溶液与Fe3+（多巴胺∶Fe的摩尔比为3∶1）交联生成凝胶情况

值得说明的是，Pluronic聚合物是温度敏感的高分子材料，目前水凝胶相关实验控制在恒温～20℃进行，PluF127-DOPA-Fe3+的温度敏感性能正在研究当中。

2.3 PluF127-DOPA-Fe3+交联水凝胶的自修复性

PluF127-DOPA-Fe3+交联水凝胶不仅具有粘弹性而且具有自我愈合的功能。图6显示PluF127-DOPA-Fe3+（PluF127-DOPA浓度为15%（wt/v））凝胶后的自愈性。PluF127-DOPA-Fe3+凝胶（图6（a))被切成两段后，然后再将两段沿断裂面接触，这两块胶能自发地在一分钟内快速的愈合在一起（图6 (b)和(c)）。融合后没有观察到两段胶之间明显的界限。

图6 PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶的自愈性

这种自愈合现象可归因于在Fe3+和多巴残基儿茶酚之间可逆的配位性质[11]。Messersmith等已经利用原子力显微镜技术表明金属离子与多巴儿茶酚之间的配位作用较共价作用弱而又比氢键强，而且具有可逆性和动态性[12-13]。图7是流变仪监控PluF-DOPA-Fe3+凝胶切断后，粘弹性能的恢复。PluF127-DOPA-Fe3+水凝胶在剪切应力的作用下（经过1000%形变后）发生断裂后，其弹性模量可在1～2 min内回复到断裂前的数值，呈现具有自我修复的功能。

图7 PluF-DOPA-Fe3+水凝胶在剪切形变（1000%）后粘弹性能恢复

3结论

采用对硝基苯基氯酸甲酯作为端羟基活化剂，合成和表征了多巴胺修饰的Pluronic F127 （PluF127-DOPA）。在一定温度、浓度和pH调控下，多巴胺基团与金属Fe3+发生配位，引起Pluronic聚合物交联生成水凝胶（PluF127-DOPA-Fe3+）。该凝胶具有黏附、pH响应和自我修复等多功能特性，这主要是由于多巴残基儿茶酚基团与Fe3+形成了可逆的有机金属络合物。该材料将在生物医学工程和水下机械涂层等领域具有潜在应用。

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（责任编辑：朱联九）

Preparation of Multifunctional Hydrogels Formed by Complexation of Fe3+-DopaMine Modified Pluronics

HUANG Kui，XIAOWang-chuan，SU Zhi-zhong,HEWang-long，HUANG Zhi-qiang,WANG Long-jiang

(School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Intelligent hydrogels have attracted much attention due to their ability to respond to external triggers.Hydroxyl end groups of Pluronic F127 were activated by p-nitrophenyl chloroformate and then reacted with dopamine to forMPluF127-DOPA,which was characterized by1H NMR and UV-Vis spectroscopy with high dopamine and Pluronic F127coupling efficiency of 98.0%.At certain temperature and PluF127-DOPA concentration（≧13%（wt/v），dopamine:Fe3+=3∶1）, DOPA group w ill coordinate with Fe3+with stoichiometry changed froM Mono-to bis-to tris,respectively,with increase of pH froM3.5 to 12,initiating cross-linking of Pluronic F127 to forMa PluF127-DOPA-Fe3+hydrogel.This novel hydrogel exhibitsmultifunction,such as pH-sensitive and self-healing properties.Oscillatory rheometry demonstrated that the hydrogel recovered storage modulus(G')within minutes after failure induced by shear strain,with potential applications in biomedicine and underwater coatingmaterials.

dopamine；Pluronic;Fe3+complexation;pH induced；self-healing；hydrogels

Q 648．17

A

1673－4343（2016）06－0008－08

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．002

2016－06－08

福建省科技厅自然科学基金项目（2013J01055）；国家自然科学基金项目（51302151）。

黄葵，女，吉林长春人，博士。主要研究方向：材料化学、高分子材料、生物材料。