仙草总皂苷的超声波法提取工艺研究

黄宗健，肖旺钏，郑可利

(三明学院资源与化工学院，福建三明365004)

仙草总皂苷的超声波法提取工艺研究

黄宗健，肖旺钏，郑可利

(三明学院资源与化工学院，福建三明365004)

目的：在不同的实验条件下提取仙草总皂苷，得到最佳提取条件。方法：采用乙醇浸泡的条件下，以超声波辅助提取仙草总皂苷，通过单因素实验对仙草总皂苷的提取时间、溶剂浓度、提取温度、料液比等因素的探究，正交试验优选最佳提取工艺，利用分光光度法测定仙草中总皂苷的含量。结果：最优提取条件经过实验结果分析确定为超声时间40Min、乙醇浓度70%、提取温度40℃、料液比1∶25，8．48%是在此条件下所达到的提取率。结论：实验所确定的最佳条件可以提高效率，节约成本，操作方便。

仙草；总皂苷；超声波辅助；正交试验

仙草叫仙人草、凉粉草，目前在中国有3种Mesona chiensis Benth,Mesona paruifso ta(Benth) Brea,Mesona procumbens Hemsl，在福建、广东、台湾等东南沿海一带均有种植，印度、印度尼西亚、马来西亚也有少量分布。仙草茎方柱,有时对生分枝,表面灰竭色或棕黄色,被疏毛或刚毛,幼枝毛明显,有沟槽,嫩茎常扭曲。质韧,断面白色,中空。叶对生,多皱缩或破碎,展平后呈卵状长圆形,叶子上端钝尖，下部成柄状,页面边缘有锯齿,两面都长有稀疏的绒毛,纸质,稍柔韧[1]。仙草可以药食两用，《中药大辞典》中有记载：仙草性寒，味甘、涩，有清热解渴，解暑利尿的功效[2]。现代医学分析仙草成分后认为仙草具有镇静、降温、降血糖、抗氧化等作用[3]。仙草不宜直接食用，将植株晒干后煎汁与米浆一起煮，冷却以后变成黑色胶状物，拌上糖后是解暑胜品[4]。仙草中碳水化合物含量较高，同时还存在少量的维生素、色素等，还含有微量元素铁、锰、锌、钾、钙等，此外仙草中还含有对人体有益的黄酮、皂苷、多糖、酚类等成分。在抑菌、抗氧化、抗氧化损伤保护、抗缺氧等方面有一定的作用[5]。

提取皂苷类化合物有很多方法，如温浸法、回流法[6]、超声波法[7]、微波法、高效液相色谱法等[8]，超声波法在提取皂苷上有较好的效果，可以较好的保证提取物的有效功能，并且节省提取时间，节约成本[9-13]。本实验以仙草为原料，在提取仙草总皂苷是使用超声波作为辅助，进行仙草中总皂苷的提取，寻找提取仙草总皂苷最优条件。

本实验是建立在前人的经验和实验基础上，提取仙草的总皂苷，并且对提取工艺进行探究，确定最佳工艺。通过超声波辅助提取的方法提取总皂苷，以紫外可见光分光光度法测定其含量[14-15]，然后分析仙草在不同因素下的提取结果，比较结果的不同点，最后选取出最好的提取条件，为开发利用仙草提供理论依据。

1实验操作

1.1材料、试剂、仪器

1.1.1材料、试剂

仙草（产地：福建三明）；95%乙醇；无水乙醇；冰醋酸；高氯酸（试剂均为分析纯）；5%香草醛-冰醋酸溶液（现配）；熊果酸（上海源叶生物科技有限公司）。

1.1.2实验仪器

Uv-722型紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器）；KQ2200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52B旋转蒸发仪（上海博经经贸）；FA/JA型电子天平（上海精密科学仪器）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸）；SYP智能型玻璃恒温水浴锅（巩义市子华仪器）；高速中药粉碎机VF-111(瑞安市永历制薬机械有限公司)；玻璃仪器气流烘干器KQ-C（巩义市子华仪器）。

1.2总皂苷的测定方法

皂苷与5%香草醛-冰醋酸溶液、高氯酸可以反应生成有色物，在特定波长下测定吸光度值可以得到含量[16]，本实验采用此种方法作为测定仙草总皂苷的方法。熊果酸为植物中存在的一种天然皂苷，而仙草中也含有类似熊果酸结构的皂苷[17]，所以本实验选择熊果酸作为标准品，最大吸收波长测处定样品溶液的吸光度，计算得出仙草总皂苷的含量。

1.3实验流程

将仙草进行粉碎烘干后过420μm筛，之后用乙醇溶液浸泡，在不用的条件下进行提取，提取液减压抽滤，经过蒸发浓缩、脱色、定容、显色后进行吸光度的测定，最后计算仙草中总皂苷的含量。

1.4前期准备工作

1.4.1样品预处理

将购买的仙草用中药粉碎机进行粉碎，之后过420μm筛，至于烘箱中烘干，最后倒入干燥的碘量瓶备用。

1.4.2配置实验溶液

熊果酸标准品溶液：准确称取5 mg熊果酸标准品，加入少量无水乙醇，完全溶解后转入100 mL容量瓶中，定容，备用，标准品溶液浓度为50μg/mL；5%香草醛-冰醋酸溶液[18]（现配现用）：10 mL冰醋酸中加入0.5 g香草醛摇匀溶解，完全溶解后备用；一系列梯度浓度的乙醇溶液。

1.4.3制备供试品

在干燥的碘量瓶中称取2.0000 g仙草粉末，加入乙醇溶液，浸泡30 min后进行超声提取，趁热过滤，待溶液冷却后转入旋转蒸发仪中，60℃蒸发干溶剂。往烧瓶中倒入20 mL无水乙醇溶解，完全溶解后将溶液倒入50 mL烧杯中，60℃水浴加热，溶液中加入0.5 g活性炭于脱色，脱色完成后立即过滤，之后将滤液倒入25 mL容量瓶内，定容摇匀后备用。

1.4.4测定最大吸收波长

在3个干燥的容量瓶中，分别移取标准品溶液、供试品溶液以及空白溶液5 mL，60℃水浴加热挥干溶剂，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸摇匀，60℃水浴加热15 min，用冰水冷却[18]，冰醋酸定容，摇匀。以空白溶液作为对照，标准品溶液和供试品溶液用紫外可见分光光度计在390～650 nm范围内测定其吸光度值，标准品最大吸收波长为545 nm，供试品最大吸收波长为540 nm，二者较为接近，因此将测定波长定为540 nm。

1.4.5标准曲线的测定

分别移取0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.0 mL的标准品溶液，加入6只干燥的25 mL容量瓶中，编号1～6号，60℃水浴挥干溶剂，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸摇匀，60℃水浴加热15 min，立即用冰水冷却[18]，冰醋酸定容，摇匀。在540 nm波长下，以1号溶液作为空白对照，测定2～6号的吸光度。以熊果酸含量为横坐标,吸光度为纵坐标，制作熊果酸标准曲线图，如图1所示，线性回归方程：

1.4.6总皂苷的计算公式

总皂苷提取率（%）=提取液总皂苷含量÷仙草质量×100%

其中C为由提取液吸光度值代入标准曲线回归方程得出的总皂苷质量（μg），m为仙草粉末质量（g），V为样液定容后体积（mL），V0为测定所用样液体积（mL）。

图1熊果酸标准曲线

1.5影响仙草总皂苷提取的4个因素

（1）料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；

（2）乙醇浓度：40%、50%、60%、70%、80%、90%；

（3）超声波时间：20、30、40、50、60、70 min；

（4）温度：20、30、40、50、60、70℃。

2实验结果分析

2.1单因素实验

2.1.1不同料液比对提取率的影响

称取6份质量2 g仙草粉末置于碘量瓶中，采用1.5（1）的不同料液比为基础，设定相同的乙醇浓度，超声时间，温度，在此条件下进行总皂苷提取，空白溶液作为对照，测定样品的吸光度，并计算提取率，进行实验3次，取3次实验提取率平均值做料液比对提取率影响曲线，其结果如图2所示。

在图2中可以看到，在料液比为1∶20提取率为最大值，在此之前提取率是在增大，之后的变化不大，可能是由于皂苷在乙醇溶剂中溶解度趋于饱和而造成的，为避免浪费，所以选择1∶20作为最佳的料液比，计算得到提取率的标准差为1.29，数据较为分散。

2.1.2不同乙醇浓度对提取率的影响

称取6份质量为2g仙草粉末，相同的条件下选定1.5（2）中作为唯一变量，进行总皂苷提取，测定样品的吸光度，计算提取率，进行实验3次，取提取率平均值，提取率和不同乙醇浓度的关系，如图3所示。

图2不同料液比对提取率的影响

图3不同乙醇浓度对提取率的影响

从图3可以明显看出，乙醇浓度在增大的同时提取率也在增大，最高提取率是在80%乙醇浓度时出现，然后有所下降。皂苷容易溶解在较高浓度的乙醇溶液中，但在乙醇浓度过高时，仙草中的其他物质析出，溶解在溶液内，对于提取测定总皂苷会造成影响，所以选择乙醇浓度为80%，计算得到标准差为1.18，数据也较为分散。

2.1.3不同超声时间对提取率的影响

称取6份2 g仙草粉末，1.5（3）作为不同条件，在其他条件相同的情况下，对仙草总皂苷进行提取，对样品溶液进行吸光度的测定，进行实验3次后计算提取率平均值，得到超声时间对提取率的影响关系，如图4所示。

由图4可以看出在超声时间30 min时仙草总皂苷有最大提取率，时间超过30 min后提取率开始减小，皂苷从仙草中提取出来需要时间，并且溶解在乙醇中也有最大溶解度，在超声波的作用下以及水浴加热乙醇挥发减少了皂苷的溶解，或者被氧化造成皂苷减少，30 min作为实验超声时间，而标准差为0.74，由此可以看出数据还是较为集中的。

2.1.4超声温度对仙草总皂苷提取率的影响

称取6份2 g仙草粉末，不同的条件决定为1.5（4），然后在其他的相同条件下提取仙草的总皂苷，之后以空白溶液作为照，对提取液的吸光度进行测定，再计算出结果，进行3次实验，计算提取率的平均值，最后得到温度和提取率的关系，如图5所示。

图5上得出在温度为50℃时有最高提取率，在此之前温度上升，提取率也随温度的升高在增大，后随着温度的提高提取率下降。因为温度越高溶解度越大，皂苷越容易溶于乙醇，但是温度过高会使乙醇溶剂挥发过快，造成皂苷溶解减少，提取率降低。所以选定超声温度50℃，计算得到的标准差为0.86。

2.2超声波提取仙草总皂苷的正交试验

2.2.1实验因素和水平

正交试验是为选出提取仙草总皂苷的最好条件，确定4个影响因素：料液比（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）、超声温度（D），每个因素取3个水平。评定以仙草中总皂苷含量为准，运用L934进行正交试验。超声辅助提取仙草中总皂苷正交因素表如表1所示。

图4超声时间对提取率的影响

图5温度对提取率的影响

表1超声波提取仙草总皂苷正交因素表

2.2.2正交实验设计与结果

正交实验结果见表2。

表2超声波法提取仙草总皂苷的正交实验设计与结果L934

2.2.3结果分析

影响仙草提取总皂苷的因素优先顺序可以根据表2中极差大小来得出，比较之后得出影响仙草总皂苷的提取影响因素的优先顺序是B＞C＞A＞D，也就是乙醇浓度最容易影响仙草总皂苷的提取，超声时间对提取率造成的影响稍小，料液比次之，而影响最小的因素是超声温度。对正交试验的结果分析料液比1∶25，乙醇浓度70%，超声时间40 min，超声温度40℃为提取仙草总皂苷的最佳条件。因为最佳工艺组合不在正交实验内，所以要进行验证性实验。

2.2.4最佳工艺条件验证实验

称取3份2 g仙草粉末，在2.2.3中确定的最佳条件组合进行提取总皂苷平行实验，得出3份仙草的提取率分别为8.48%、8.49%、8.48%，取平均提取率8.48%，8.48%的提取率比正交试验中的较优组合7的提取率8.45%高，可以证明经过正交试验，分析结果后选出的最佳提取条件是符合实际情况的。

3结论

（1）分析实验结果得出，作为仙草总皂苷提取剂，效果最好的是浓度为70%的乙醇溶液。皂苷作为植物中的一种有机物，根据相似相容原理，乙醇和皂苷的极性接近，所以皂苷在乙醇中的溶解度较大，作为提取剂的乙醇溶液可以进行回收，回收操作简便，所以用浓度为70%的乙醇溶液作为提取剂。

（2）仙草总皂苷提取的影响因素大小进过对正交试验的结果分析，各个因素中乙醇浓度影响最大，超声时间次之，料液比稍小，超声温度是影响最小的；以及超声波法提取仙草苷的最佳工艺条件为料液比1∶25，乙醇浓度70%，超声时间40 min，超声温度40℃，提取率达8.48%，目前对于仙草中总皂苷提取和含量测定的研究还较少，所以本文有一定的参考价值。

（3）本实验所采用的超声波法提取仙草总皂苷较其他方法相比，提取率高，提取时间短，可以有效的保护提取成分，操作简便，可以做到降低成本，高效、节能，为仙草的开发和利用提供部分参考。

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（责任编辑：朱联九）

Ultrasonic Assisted Extraction of Total Saponins in Mesona Chinensis

HUANG Zong-jian,XIAOWang-chuan,ZHENG Ke-li
(College of Resource and Chemistry Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Objective:To obtain the optimuMconditions of ultrasonic assisted extraction of total saponins in Mesona chinensis.Method:The ultrasonic assisted extraction of total saponins in Mesona chinensis was accomplished by using ethanol as solvent.Single factor experimentswere used for investigating the influences of extraction time,solvent concentration,extraction temperature,solid to liquid on extraction rate.The total saponins was measured by spectrophotometric method.The optimuMextraction process was deterMined by orthogonal test.Results:The optimuMparameters are as follows:ultrasonic time 40min,70%ethanol,extraction temperature 40℃,solid-liquid ratio 1∶25,extraction rate of 8.48%. Conclusion：this process is simpleand low costly aswellas of high effeciency.

Mesona chinensis;total saponin;ultrasonic;orthogonal test

R 284．2

A

1673－4343（2016）06－0072－06

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．012

2016－09－25

大学生创新创业项目（ZL1222/CS(sj),SD1111，STS0801）

郑可利，男，福建永泰人，教授。主要研究方向：天然产物提取与分离。