聚乙烯醇降解菌的驯化与降解条件优化

张东瑞，涂小丽，董国文，张丽华，王仁章

（1.福建省资源环境监测与可持续利用重点实验室，福建三明365004；2.三明学院资源与化工学院，福建三明365004）

聚乙烯醇降解菌的驯化与降解条件优化

张东瑞1,2，涂小丽1,2，董国文1,2，张丽华1,2，王仁章1,2

（1.福建省资源环境监测与可持续利用重点实验室，福建三明365004；2.三明学院资源与化工学院，福建三明365004）

为了实现纺织工业废水中PVA的生物降解，从活性污泥中驯化得到对PVA具有降解能力的混合菌种，并对降解条件进行了优化。在最优条件下能在8 d对浓度为5g/L的PVA降解率达到87.5%。该混合菌体系为共生菌种，能够有效代谢无机氮源氯化铵来降解PVA。

聚乙烯醇；混合菌体；生物降解

聚乙烯醇（PVA）是一种具有水溶性的高分子合成化合物，广泛应用于粘合剂、涂料、乳化剂、造纸和纺织等行业[1]。由于其可生化性差、难降解、易积累，对环境造成很大的污染[2]。自1973年成功分离出第一株以PVA为唯一碳源的降解菌以来，研究者们对PVA的生物降解进行了广泛研究[3]。但降解PVA的初始浓度普遍不高，大部分微生物降解PVA的浓度在0.1%-2.0%之间[4-7]。在环境中能够自然降解PVA的微生物不多，纯菌更是难于降解高浓度的PVA废水，所以混合菌株是一个不错的选择[8]。作者采用PVA长期存在环境下福建福维污水处理厂的活性污泥，对其进行驯化得到能够有效降解PVA的混合菌种，并研究相关因素提高PVA的降解效果和速率，为进一步深入研究该混合菌种的应用提供参考。

1实验材料与方法

1.1材料和试剂

活性污泥采自福建福维污水厂曝气池，PVA类型1788（福建福维生产）。液体培养基PVA1788 5 g/L，酵母粉2 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO40.25 g/L，MgSO40.06 g/L，CaCl20.05 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，NaCl0.02 g/L，调pH到7.5。固体培养基在液体培养基基础上加入琼脂20 g/L(4%)，调pH至7.5。

1.2驯化方法

取适量活性污泥接入含有适量PVA的无机盐培养基中，以PVA作为唯一碳源进行摇瓶培养，不断驯化富集，进行筛选，获得能够有效降解PVA的菌种。摇瓶培养：将驯化好的污泥以4%的接种量（体积）加入装有100 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中，摇瓶转速150 r/min，28℃培养。

1.3测试方法

根据Finely法[9]，PVA在硼酸的情况下与I2产生反应，于690 nm下测试其光密度值，通过标准曲线进行换算乘以稀释倍数得到PVA的浓度(TU1900，北京普析)。菌体生长情况测定：用比浊法测定，取2 mL菌株培养液，稀释3倍后，每隔24 h在波长600 nm处测其OD600。

1.4混合菌种群分析

通过提取样品中微生物的总DNA，采用引物F338GC-R518进行PCR扩增[10]，然后进行DGGE凝胶电泳，割胶回收，克隆测序（上海生工）。

2结果与讨论

2.1 PVA降解菌的驯化

将活性污泥以4%的体积接种量接入装有100 mL液体培养基的锥形瓶中，摇瓶转速150 r/min，28℃培养，培养1个半月后，逐步提高PVA浓度(PVA浓度由1 g/L提高到5 g/L)，经过5个周期的再驯化，获得能够有效降解PVA的混合菌种，结果见图1。

由图1可知，经过驯化的混合菌株能够有效降解高浓度的PVA模拟废水。混合菌株对5 g/L PVA降解率在第10 d达到73.9%。相对应地，混合菌株的生物量在第2 d达到最大值，之后变化相对稳定。

取驯化好的种子液，稀释成倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的悬浮液，分别吸取0.5 mL的10-4和10-5的悬浮液均匀涂在固体培养基上，在28℃的恒温培养箱中倒置培养24 h，然后加入碘-硼酸溶液，于暗处反应10 min拿出观察菌落周围或菌落下产生透明圈情况，根据菌落形态和透明圈大小，挑出3株纯菌株分别接种到液体培养基中培养（PVA浓度为1 g/L）。

图1 PVA的降解和混合菌株生长情况

从图2可以看出，单菌株对PVA的降解效果非常差，该体系为混合菌[11]，接下来的环境条件优化实验采用混合菌种。

图2单菌株对PVA的降解情况

测序结果在http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch上比对，并提交到NCBI，结果见表1。通过测序发现主要降解PVA微生物有9种优势菌株，其中鞘氨醇单胞菌属已有报道能够降解PVA[12]，其它菌株还未见相关报道。

表1 9种优势菌株16S rDNA序列比对结果

2.2不同氮源对菌体生长和PVA降解的影响

为了提高PVA降解效率，以1.0 g/L PVA作为唯一碳源，考察不同氮源对该混合菌体生长和PVA降解的影响(总氮含量相等)，氮源种类及使用量分别为氯化铵（0.83 g/L）、尿素（0.4 5g/L）、硝酸钠（1.29 g/L）、酵母粉（2.16 g/L）、蛋白胨（1.77 g/L）、硫酸铵（1.00 g/L），考察其在pH7.5，摇瓶转速150 r/min，28℃培养3 d，结果如图3所示。

从图3可以看出，在有机氮源中，酵母粉和蛋白胨都有利于菌体的大量生长，以无机氮作为氮源时，菌体生长量较有机氮源小，且差距明显。然而，降解PVA最多的并不是有机氮源，而是无机氮源，其中氯化铵作为氮源时混合菌体降解PVA的速率最快，其次是硝酸钠，菌体生长量很高的酵母粉和蛋白胨都没有能够有效降解PVA。崔双科等研究发现菌体在以酵母膏为氮源时生长非常好，但是酶活很低，究其原因可能是菌体在代谢有机氮源时会产生一些粘性物质，减小了细胞的表面积以及影响细胞分泌PVA降解酶，从而导致菌体代谢有机氮源时PVA降解率比较低[13]。

图3不同氮源对混合菌体生长和PVA降解的影响

综上表明氮源对微生物降解PVA起着关键性作用。因此后期实验中只加入氯化铵，并考察了其浓度对混合菌体降解PVA的影响。分别以浓度为0.2，0.5，0.8，1.0，2.0，5.0 g/L的氯化铵取代原培养集中的浓度，在pH7.5，摇瓶转速150 r/min，28℃培养3 d，结果如图4所示。

图4不同氯化铵浓度对混合菌体PVA降解能力的影响

根据图4可知，氯化铵浓度在0.2～0.8 g/L之间，PVA降解率随着氯化铵浓度的增加而上升，在0.8 g/L时达到最大值。随着氯化铵浓度的继续增加，PVA降解率逐渐下降，这可能是加入过多的氮源，导致氮碳比过高，引起菌体不适，所氯化铵的最适浓度为0.8 g/L。

2.3外加碳源对菌体生长和PVA降解的影响

在以PVA作为唯一碳源时，此混合菌体降解高浓度的PVA废水时周期过长，需要一周时间左右，因此考虑采用混合碳源，辅助其它碳源来促进菌体生长，从而缩短降解周期。在PVA含量为1.0 g/L的液体培养基中，分别添加淀粉、蔗糖、葡萄糖（1.0 g/L），在pH7.5，摇瓶转速150 r/min，28℃培养3 d，结果见图5。

由图5可知，辅助其它碳源能够促进菌体生长，但PVA的降解率反而下降了，表明添加其它有机碳源并没有促进PVA的降解，而是拟制PVA的降解。崔双科等在研究混合菌系产酶营养条件时发现，添加其它碳源有利于菌体的生长，但同时拟制了PVA降解酶的酶活，从而导致PVA降解率的下降[13]，故在之后的实验中不再添加其它碳源。

图5不同碳源对混合菌体生长和PVA降解的影响

2.4不同PVA浓度对混合菌体PVA降解能力的影响

在优化氮源和碳源的基础上，调整培养液中PVA浓度分别为2、4、6、8、10 g/L，考察在pH=7.5摇瓶转速150 r/min，28℃培养8 dPVA降解及菌体生长情况，结果如图6所示。

图6不同PVA浓度对混合菌体PVA降解能力的影响

在PVA浓度小于6 g/L时，菌体生长量随PVA初始浓度的增加而增加，当PVA浓度为6 g/L时，菌体生长量达到最大，此后，菌体生长量随PVA初始浓度的增加而递减。随着PVA初始浓度的增加混合菌体PVA降解率逐渐降低，在PVA浓度为10 g/L时，几乎不再降解PVA，所以PVA浓度10 g/L是该混合菌体降解PVA的最大耐受值。

2.5 MgSO4和FeSO4·7H2O对混合菌体PVA降解能力的影响

微生物的生长需要一定的微量元素，但某些微量元素会抑制微生物的活性。在前期优化条件的基础下，PVA浓度为5 g/L，其中MgSO4和FeSO4·7H2O添加量分别为0.06和0.02 g/L，pH=7.5，摇瓶转速150 r/min，28℃培养8 d，PVA降解情况如图7所示。

图7 MgSO4和FeSO4·7H2O对混合菌体PVA降解能力的影响

从图7可知，只添加亚铁离子的样品中，PVA的降解率最高，达到87.5%，没有矿质元素加入的空白样品为68.3%，说明亚铁离子有促进混合菌体降解PVA。只加入镁离子的降解率为56.3%，低于空白值，混合加入亚铁离子与镁离子的降解率为79.92%，高于空白样品的降解率，但低于只加入亚铁离子的降解率，镁离子的加入使PVA降解率明显下降，这说明镁离子对微生物的生物活性有一定的拟制作用。

3结论

以PVA为唯一碳源，运用摇瓶培养富集方法，从活性污泥中驯化得到对PVA具有降解能力的混合菌种，在最优条件下能在8 d对浓度为5 g/L的PVA降解率达到87.5%。该混合菌能够有效代谢无机氮源来降解PVA。

对该混合菌体降解条件进行了优化，得到如下实验结果：（1）PVA降解的最佳氮源为0.8 g/L氯化铵；（2）外加1.0g/L淀粉、蔗糖、葡萄糖，均可提高菌体的生长量但抑制了PVA的降解；（3）PVA浓度10g/L是该混合菌体降解PVA的最大耐受值；（4）铁离子对PVA的降解有促进作用，而镁离子抑制其降解。该体系最佳PVA降解培养基：NH4Cl0.8 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO40.25 g/L，CaCl20.05 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L，调pH至7.5。

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（责任编辑：朱联九）

Screening of PVA-Degrading Strains and OptiMization of Degradation Conditions

ZHANG Dong-rui1,2,TU Xiao-li1,2,DONG Guo-wen1,2, ZHANG Li-hua1,2,WANG Ren-zhang1,2

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring&Sustainable Management and Utilization，Sanming 365004，China；2.College of Resource and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004，China)

In order to achieve the biodegradation of PVA in the textile industrialwastewater,a bacteriaMixture capable of degrading PVA was obtained froMactivated sludge.Simultaneously，the degradation conditionswere optiMized.Under the optimal conditions,the PVA degradation rate after 8 dayswas 87.5%in themediuMwith 5 g/L PVA.ThisMixed bacteriuMis symbiotic bacteria,which can effectively utilize the inorganic nitrogen source NH4Cl to degrade PVA.

polyvinylalcohol;mixed bacteria;biodegradation

X 172

A

1673-4343（2016）06-0078-05

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．013

2016-09-29

福建省科技厅重点项目（2014Y0072）；大学生创新计划项目（201211311010）；2011洁净煤气化技术协同创新中心开放课题（XK1404）

董国文，男，安徽宿松人，博士，副教授。主要研究方向：污染环境生物修复。