响应面法优化微波-超声波辅助提取茶皂素工艺研究

陈小红，吴德武，龙娟娟

（1．龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；2．龙岩学院化学与材料学院，福建龙岩364012）

响应面法优化微波-超声波辅助提取茶皂素工艺研究

陈小红1，吴德武2，龙娟娟2

（1．龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；2．龙岩学院化学与材料学院，福建龙岩364012）

以油茶籽粕为原料，乙醇水溶液为浸提液，通过微波－超声波辅助提取茶皂素，在超声波功率80W，超声波作用时间50Min的条件下，考察乙醇浓度、料液比、微波功率和浸提时间对茶皂素提取率的影响，在单因素试验基础上，以茶皂素浸提得率为响应值通过响应面法优化茶皂素的浸提提工艺。以反相柱层析法纯化提取的茶皂素，对纯化的茶皂素以红外、紫外光谱进行表征。结果表明，超声波功率80W，超声波作用时间50Min的条件下，茶皂素的提取工艺为：乙醇浓度77%，料液比1∶20(g∶ML)，微波功率714W，浸取时间336s，在优化条件下，茶皂素浸提得率为（8．1±0．3)%，其纯度为65．2%，微波－超声波辅助在浸提中表现出协同作用。反相柱层析法纯化提取的茶皂素，可得到高纯度茶皂素。

茶籽粕；微波；超声波；茶皂素；反相柱层析；红外

油茶籽粕是食用油茶籽榨油后得到的残渣，是提取茶皂素的天然原材料之一，从油茶籽粕中提取得到的茶皂素又叫做茶皂甙，是一类复杂的糖苷化合物，具有良好的表面活性，表现出较强的发泡、乳化、分散、湿润等作用，并具有抗菌、消炎、镇痛、抗癌等生理活性，大量应用于农业、纺织业、建筑建材、日用化工等行业[1-3]。受产地、品种以及榨油工艺的影响，油茶籽粕中茶皂素的含量大致在10%～15%[3]。由于微波在辐射过程高频电磁波可穿透介质直接作用于植物内部细胞的效果，超声波在介质传播中产生特殊的“空化效应”，近年来，微波提取与超声波提取技术被广泛应用在茶皂素的提取工艺研究中[4-9]。基于微波、超声波辅助提取技术能够很好地提高油茶籽粕中茶皂素的提取得率，本实验固定超声波功率80W，超声波作用时间50 min的条件下，通过响应面法优化微波-超声波协同辅助提取茶皂素的提取工艺条件。

1材料与方法

1.1实验仪器

KQ-100DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；MG08S一203型微波仪(南京汇研微波系统工程有限公司)；YP-B5001电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；DK-98-II电子恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；UV-5600紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；Nicolet Avatar330傅立叶红外光谱仪，（美国Termo Electron公司）；SHZ-DⅢ循环水式真空泵（巩义市子华仪器有限公司）；索氏提取器；抽滤装置一套。

1.2实验材料及试剂

油茶籽粕（龙岩市茶丽健茶油开发有限公司）；茶皂素标准品（上海阿拉丁试剂有限公司）；无水乙醇（AR）（西陇化工股份有限公司）；50μMODS-A反相硅胶填料（日本YMC公司）；香草醛(香兰素)（≥99%)（西陇化工股份有限公司）；硫酸（AR）（95%～98%）（西陇化工股份有限公司）；无水甲醇（AR）（西陇化工股份有限公司）；石油醚（AR）（西陇化工股份有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1油茶籽粕中茶皂素的提取

油茶籽粕粉碎过80目筛，称取30 g于索氏提取器在石油醚中回流脱脂24 h，取出烘干。重复此操作，制备脱脂油茶籽粕若干备用。然后称取5.0 g的脱脂茶籽粕粉末放入100 mL烧杯中加一定体积浓度的乙醇溶液，搅拌分散均匀，在超声波功率80W下，超声波作用时间50 min，之后取出，在微波仪中分别按不同微波功率、微波提取时间的条件下，进行浸提。浸提完毕，减压抽滤得到茶皂素浸提液，测定滤液体积V，装入锥形瓶中。

1.3.2浸提液中茶皂素含量的测定[9]

采用80%的乙醇溶液为溶剂，称取茶皂素标准品，准确配制180、360、540、720、900μg/mL的标准溶液。用移液枪取1.00 mL茶皂素标准溶液加入试管中，往其中加入1 mL 8%香草醛乙醇溶液和10 mL 77%硫酸溶液，充分混合摇匀后，置于60℃恒温水浴中反应15 min，取出后置于冰水浴中冷却10 min，放至室温，把液体移入玻璃比色皿，以蒸馏水为参比，在波长为550 nm处测定溶液的吸光度，以茶皂素质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，拟合得回归方程为y＝1247.3994x-30.5605，R2＝0.9997。

准确移取茶皂素滤液1.00 mL至250 mL容量瓶中，以80%的乙醇溶液为溶剂，定容摇匀待测，取1.00 mL定容后的稀释茶皂素液加入试管中，采用上述方法测定溶液的吸光度，根据茶皂素浓度-吸光值标准曲线拟合得到的方程，求得稀释定容后茶皂素溶液的茶皂素含量，进而求出茶籽粕中茶皂素提取得率：

其中x为稀释定容后茶皂素溶液的吸光值；N=250为稀释的倍数；V为茶皂素滤液体积；W=5.0为茶籽粕质量。

1.3.3茶皂素的反相柱层析纯化[10-11]

以50μMODS-A反相硅胶为填料，采用无水乙醇匀浆湿法上柱。称取3 g提取、干燥后的茶皂素溶解在40 mL 5%的甲醇溶液，通过分液漏斗控制于1 mL/min速度上样，以1.5 mL/min的洗脱速度，梯度洗脱，先采用50%的甲醇溶液以2倍柱床体积淋洗；再用60%的甲醇溶液以2倍柱床体积淋洗，每2 min收集1份洗脱液，对每份洗脱液进行紫外吸光检测。对215 nm处有强吸收峰的洗脱液进行浓缩、干燥。

1.3.4茶皂素纯化物表征[10-11]

（1）紫外扫描

以60%甲醇溶液为溶剂，将纯化后的茶皂素配置成浓度为0.5 mg/mL的溶液，进行紫外扫描，得到紫外扫描光谱图。

（2）傅立叶红外扫描

取微量纯化后茶皂素样品与KBr混合后压片，进行红外扫描，得到红外扫描光谱图。

2结果分析

2.1微波-超声波辅助单因素浸提茶皂素试验

2.1.1微波功率对茶皂素得率的影响

称取脱脂茶粕粉末5.0 g若干份，按固液质量比1∶7，乙醇浓度60%，浸提时间为280 s，调节微波功率，将所得提取液过滤，保留于带塞锥形瓶中备用并检测其茶皂素含量。微波功率对茶皂素得率的影响结果如图1所示。由图可知，微波功率对茶皂素的提取有一定的影响，随着微波功率的增大，茶皂素得率逐渐增大，当微波功率为700W时,茶皂素得率达到5.8%。因此，提取茶皂素适宜的微波辐射功率为700W。

2.1.2微波辐射时间对茶皂素得率的影响

取脱脂茶粕粉末5.0 g若干份，按固液质量比1∶7，乙醇浓度60%，微波功率700 W，调节微波时间分别为160、200、240、280、320、360、400 s浸提茶皂素，将所得提取液过滤，保留于带塞锥形瓶中备用并检测其茶皂素含量。微波辐射时间对茶皂素得率的影响如图2所示。从图可以看出，微波辐射时间对茶皂素的提取影响较大，初始时随着微波辐射时间延长，茶皂素的得率逐渐增加，当微波辐射时间为320 s时，茶皂素的得率为6.4%；继续延长微波辐射时间，茶皂素得率变化不大。因此，取320 s为合适的微波辐射时间。

图1微波功率对茶皂素提取效果的影响

图2微波时间对茶皂素提取效果的影响

2.1.3料液质量比对茶皂素得率的影响

称取脱脂茶粕粉末5.0 g若干份，按乙醇浓度60%。浸提时间为320 s，微波功率为700W，固液质量分别按1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 g/mL浸提茶皂素，将所得提取液过滤，保留于带塞锥形瓶中备用并检测其茶皂素含量。料液质量比对茶皂素得率的影响结果如图3所示，随着固液质量比增大，茶皂素的得率升高，当固液比达到1∶16时，茶皂素得率为6.7%，继续增加微波辐射固液质量比，茶皂素得率变化不大，因此，取1∶16 g/mL为合适的料液质量比。

2.1.4乙醇浓度对茶皂素得率的影响

称取脱脂茶粕粉末5.0 g若干份，按料液质量比1∶16 g/mL，微波功率为700W，浸提时间为320 s，乙醇浓度分别为50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%浸提。将所得提取液过滤，保留于带塞锥形瓶中备用并检测其茶皂素含量。不同乙醇浓度对茶皂素得率的影响结果如图4所示，由图可知，随着乙醇浓度的增大，茶皂素得率逐渐增大，当乙醇浓度为70%时，茶皂素得率达到7.1%，继续增大乙醇浓度，茶皂素得率降低。因此，取乙醇浓度70%时为合适的提取溶剂。

图3料液质量比对茶皂素提取效果的影响

图4乙醇浓度对茶皂素提取效果的影响

2.2微波辐射提取茶皂素的工艺优化

2.2.1响应面法优化微波辐射提取茶皂素的工艺条件

根据上述单因素试验的结果，通过Box-Behnken试验设计方案，考察乙醇浓度、料液比、微波功率、浸提时间四因素对茶皂素提取得率的影响，以茶皂素提取得率为响应值，利用Design Expert软件进行数据拟合，优化提取工艺参数。试验因素与水平见表1。根据设计的试验方案进行茶皂素的浸提，结果见表2。对试验的结果进行回归分析，结果见表3。

表1因素与水平

表2 Box-Behnken实验设计及响应值

表3 Box-Behnken实验设计及回归分析结果

续表3

由表3模型的F值=12.88表明模型是显著的，即模型的模拟值只有0.1%的可能性是由干扰噪声而引起误差，说明模型分析具有统计学意义。对表2实验的结果进行回归分析得到方程：茶皂素得率(%)=-374.8137+6057A+62207037B+ 0.11362C+0.42742D–7.66667AB–8.5E-4AC–2.5E-3AD+0.13333BC+0.08333BD+2.5E-5CD–0.30533A2–1559.25926B2–4.25833E-5C2–3.83333 E-4D2，方程的R2=0.9280说明方程的拟合程度较好，图5中回归方程的残差正态图呈一条直线，说明回归分析得到的方程拟合程度好，可信度高，通过方程可以很好地预测实验结果，模型的“Prob﹤F”﹤0.05、失拟项p=0.0264﹤0.05显著，表明模型的可信度高，可以通过该模型优化茶皂素的浸提工艺条件。由表3中的“P”可知A、B，A、C，A、D因素的交互影响显著，因此本文只考察A、B，A、C，A、D双因素交互影响的响应面曲线及对应的等高线图，其结果如图6～8所示。

图5回归分析的残差正态图

由图6因素A、B响应面分析立体图及相应等高线图可知液料比B在12.98的值时，乙醇浓度在66%至80%的区间范围这内可达到响应面顶点，图7等高线图中出现圆心区间，表明在这个范围内响应值有出现最优点；由图8等高线图上出现椭圆心区，表明因素A、D对响应值茶皂素浸提得率的交互影响比因素A、C更显著。通过响应面法对表2试验结果进行最优化，获得微波—超声波辅助从茶籽粕粉浸提茶皂素的最优工艺：固定超声波功率80W，超声波作用时间50min的条件下，乙醇浓度77.2%，料液比1∶20，微波功率714.4W，浸取时间335.5 s。在优化条件下，茶皂素得率预测值为8.3%。

2.2.2响应面法优化微波辐射提取茶皂素的工艺条件的验证

对优化结果的可靠性进行验证，固定超声波功率80W，超声波作用时间50 min的条件下，取乙醇浓度77%，料液比1∶20，微波功率714W，浸取时间336 s进行微波辅助提取茶皂素，平行试验4次，结果取平均值，测得茶皂素浸提得率（8.1±0.3)%，与模型预测值基本一致，表明模型的可信度高，干燥后测得其纯度为65.2%。与预测值的相对误差为2.4%，表明响应面法建立茶皂素浸提得率的模型可信度高，能够指导从茶籽粕粉中采用微波-超声波辅助浸提茶皂素。

图6因素A、B响应面分析立体图及相应等高图

图7因素A、C响应面分析立体图及相应等高图

图8因素A、D响应面分析立体图及相应等高图

2.3同水平条件下优化工艺与微波辐射提取、超声波辅助提取工艺对茶皂素提取率的比较

取乙醇浓度77%，料液比1∶20的条件下，分别以超声波功率80W，超声波作用时间55.6 min以及微波功率714W，微波作用时间336 s，进行茶皂素的提取，平行试验4次，结果取平均值，对比优化工艺条件下茶皂素的提取率，结果如表4所示。

表4优化工艺与微波、超声波作用对茶皂素提取率的比较

由表4表明，同水平条件下，与单独采用微波辐射提取或超声波辅助提取相比较，优化工艺的茶皂素提取得率可以获得较大的提高，表明优化工艺可为油茶籽粕中茶皂素提取的工业生产提供重要的参考价值。由微波－超声波协同辅助提取的茶皂素得率(8.1%)大于单独采用微波辐射提取或超声波辅助提取的茶皂素得率之和(7.5%)，表明微波辐射与超声波辅助在茶皂素浸提中表现出协同作用。

2.4反相柱层析纯化后茶皂素的表征

按优化的微波-超声波辅助工艺提取茶籽粕粉中的茶皂素，对提取、干燥获得的茶皂素进行反相柱层析纯化，纯化后样品的红外吸收光谱如图9、紫外吸收光如图10所示。

图9茶皂素红外图谱

图10茶皂素紫外图谱

由图9可见，在2920、2850 cm-1处出现茶皂素烷烃配基的C—H伸缩振动吸收峰。在1610 cm-1处出现C=C伸缩振动吸收峰，在1385 cm-1处出现—OH伸缩振动吸收峰，在1075、1045 cm-1与处出现C—O伸缩振动强吸收峰，与文献报道的茶皂素红外光谱值基本一致[12]。由图10可见反相柱层析纯化后的样品在紫外吸收光区仅于波长215 nm处有最大吸收峰，与文献相符[13]，在波长230 nm后没有出现明显的吸收峰，表明茶皂素提取物中的单宁、黄酮等杂质得到了有效的分离，纯化后的样品纯度高。

3结论

通过响应面法优化微波－超声波协同辅助提取茶皂素，得到浸提茶皂素模型：茶皂素得率(%)= -374.8137+6057A+62207037B+0.11362C+0.42742D–7.66667AB–8.5E-4AC–2.5E-3AD+ 0.13333BC+0.08333BD+2.5E-5CD–0.30533A2–1559.25926B2–4.25833E-5C2–3.83333E-4D2；最优浸提工艺：固定超声波功率80W，超声波作用时间50min的条件下，乙醇浓度77%，料液比1∶20，微波功率714W，浸取时间336 s。在优化条件下，茶皂素浸提得率为（8.1±0.3)%，其纯度为65.2%；同水平条件下与单独采用微波辐射提取或超声波辅助提取比较，优化工艺条件下茶皂素的提取得率可以获得较大的提高，可为油茶籽粕中茶皂素提取的工业生产提供重要的参考价值。微波辐射与超声波辅助在优化工艺中表现出协同作用。通过反相柱层析纯化提取的茶皂素，可得到高纯度茶皂素。

［1］付玲，于森．茯苓研究的新进展［J］．新疆中医药，2005，23（3）：79－83．

［2］汪多仁．茶皂素的应用开发［J］．北京日化，2002，67（2）：15－19．

［3］刘红梅，周建平，郭华，等．油茶皂素提取纯化及含量检测研究综述［J］．现代食品科技，2006，22（4）：265－268．

［4］吴雪辉，张喜梅．茶皂素微波提取过程的优化及数学描述［J］．华南理工大学学报（自然科学版），2009，37（4）：125－129．

［5］张卫国．茶皂素微波辅助提取新工艺条件研究［J］．韶关学院学报（自然科学版），2011，32（4）：45－48．

［6］杜志欣，张崇坚，万端极．超声波辅助乙醇法提取茶皂素工艺优化［J］．化学与生物工程，2015，32（3）：56－59．

［7］何自强，张惠玲，张新欢．超声波辅助乙醇－氨水提取茶皂素的工艺研究［J］．湘潭大学学报（自然科学版），2015，37 （2）：80－85．

［8］张宁，马朝阳，娄在祥，等．超声－微波协同辅助萃取茶皂素［J］．中国油脂，2013，38（8）：77－80．

［9］刘红梅，周新跃，周建，等．油茶皂素定量分析的研究［J］．生命科学仪器，2008，6（10）：13－16．

［10］张志强，苏志国．正相和反相柱层析组合分离纯化紫杉醇［J］．生物工程学报，2000，16（1）：69－73．

［11］张海龙，张维农，蒋继，等．茶皂素纯化方法的比较及其组分的鉴定［J］．中国油脂，2015，40（11）：94－98．

［12］钟平．微波辐射法从茶籽饼中提取茶皂素［J］．食品工程·技术，2009（5）：111－112．

［13］王林，苟筱辉．茶皂素紫外吸收光谱的研究［J］．中国茶叶，1990（2）：32－33．

(责任编辑：朱联九）

The Research on the OptiMization of Technology Process by Response Surface Method

CHEN Xiao-hong1,WU De-wu2，LONG Juan-juan2

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，China 2.College of Chemistry&Materialse，Longyan University，Longyan 364012，China）

TheMicrowave and ultrasonic assisted extraction of tea saponin froMdefatted oil-tea seed cakewasstudied in this paper．Under the condition of ultrasonic power 80 W,radiation for 50 Min,the effects of ethanol concentration,liquid-solid ratio,Microwave powerand extracting time on tea saponin extraction yield were studied.On the basis of single factor experiment,the optiMized extraction processof tea saponin through the response surfacemethod,on tea saponin yield response value,was studied.Tea saponin was purified by reversed phase column chromatography and was characterized with IR,UV spectra.Experimental results show that the optiMized extraction processwas:the concentration of ethanolwas 77%,the solid-liquid ratio was 1∶20(g∶ML),microwave powerwas 714W,extracting time was 336s.At the optimal condition,tea saponin extraction yield was（8.1±0.3)%and its purity was up to 65.2%.Themicrowave and ultrasonic assisted extraction showed synergy in thisexperimentand tea saponin ofhighly puritywasobtained by reversed phase column chromatography.

oil-tea seed cake;Microwave;ultrasonic;tea saponin;reversed phase column chromatography;IR

TQ 914

A

1673－4343（2016）06－0064－08

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．011

2016－09－19

龙岩学院“攀登项目”（LQ 2013018）

陈小红，女，福建永定人,实验师。主要研究方向：天然产物开发。通讯作者：吴德武，男，福建连城人,讲师。主要研究方向：天然产物开发。