红豆杉多糖对免疫功能低下小鼠细胞免疫功能的影响

朱慧民 李露露 蔡远榛 陈琪 陈华群 张娅丽

红豆杉多糖对免疫功能低下小鼠细胞免疫功能的影响

朱慧民 李露露 蔡远榛 陈琪 陈华群 张娅丽

目的 探讨红豆杉多糖增强免疫低下小鼠免疫功能的机制。方法 将48只昆明小鼠按随机数字表法分为正常对照组，氢化可的松模型组，红豆杉多糖低、中、高剂量组及猴头菇多糖阳性对照组，每组8只。除正常对照组外，其余各组小鼠皮下注射氢化可的松0.2mg/kg，隔天1次，共14 d，制备小鼠免疫功能低下模型。正常对照组和氢化可的松模型组予0.9%氯化钠溶液10ml/kg灌胃，红豆杉多糖低、中、高剂量组分别予等量不同浓度10、20、40mg/ml红豆杉多糖溶液灌胃，猴头菇多糖阳性对照组予等量浓度为1.1mg/ml猴头菇多糖溶液灌胃,均1次/d，连续14d。流式细胞术检测小鼠血CD4+、CD8+细胞百分比，ELIAS法检测血清IL-4水平，测量小鼠胸腺指数。结果 与正常对照组比较，氢化可的松模型组CD4+、CD8+细胞百分比均明显降低（P＜0.01），红豆杉多糖低、中、高剂量组与氢化可的松模型组对比，CD4+、CD8+细胞百分比均有所增加（均P＜0.05），其中红豆杉多糖中剂量组能降低CD4+/CD8+比值（P＜0.05）。与正常对照组比较，氢化可的松模型组血清IL-4水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；红豆杉多糖低、中、高剂量组IL-4水平均高于氢化可的松模型组（P＜0.05或0.01）。氢化可的松模型组与正常对照组比较，胸腺指数明显降低（P＜0.01）。红豆杉多糖低、中、高剂量组及猴头菇多糖阳性对照组与氢化可的松模型组比较，胸腺指数均有所增加（P＜0.05），其中红豆杉多糖中剂量组及猴头菇多糖阳性对照组均明显增高（P＜0.01）。结论 红豆杉多糖增强细胞免疫的机制它可能主要通过调节细胞免疫来增强免疫低下小鼠的免疫功能。

红豆杉多糖 T淋巴细胞亚群 胸腺指数 小鼠

红豆杉是我国一级保护植物，具有较高的观赏及药用价值，其树皮是抗肿瘤药物紫杉醇的原料，但大量的红豆杉在树皮提取紫杉醇后便被遗弃，造成资源的极大浪费。本课题组与浙江大学及省内企业合作首次以极性梯度提取技术从红豆杉科、红豆杉属植物南方红豆杉中发现、提纯并分离出“红豆杉多糖”（已获国家发明专利授权：03129421.9），并在近年研究中逐步完成其毒理学、药效学、药代学研究，发现该多糖具有抗肿瘤[1]、抗糖尿病[2]、抗氧化等作用，同时发现其具有干预心肌缺血再灌注损伤等生物学特性和功能[3-5]。笔者在前期研究中，发现红豆杉多糖可增强免疫功能低下小鼠的相关免疫功能[6]。现进一步探讨这一作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 昆明小鼠48只，7周龄，22～25g,雄性清洁级，由温州医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SYXK（浙）2010-0150。低速离心机（安徽中科中佳科学仪器公司），电热恒温水箱（一恒仪器公司），漩涡混合器（上海医大仪器厂），酶标仪（美国Aurobiio公司），全自动酶标洗板机（汇松仪器厂），流式细胞仪（美国BD公司）。抗小鼠CD8+（PE）、抗小鼠CD4+（PE）、小鼠IL-4 ELIAS试剂盒（武汉博士得生物有限公司），猴头菇多糖（中国无限极有限公司，含量90%）粉剂5g，红豆杉多糖（浙江省中医药研究所，含量90%）粉剂5g。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模与干预 按随机数字表法将48只小鼠分为6组：正常对照组，氢化可的松模型组，红豆杉多糖低、中、高剂量组及猴头菇多糖阳性对照组，每组8只。氢化可的松模型组、猴头菇多糖阳性对照组及红豆杉多糖低、中、高剂量组小鼠皮下注射氢化可的松0.2mg/kg，隔天1次，共14d，完成造模[8]。于造模第1天起，正常对照组及氢化可的松模型组小鼠予0.9%氯化钠溶液10ml/kg灌胃；红豆杉多糖低、中、高剂量组小鼠予等量红豆杉多糖溶液（将粉剂溶于0.9%氯化钠溶液配置不同浓度10、20、40mg/ml）等量灌胃；猴头菇多糖阳性对照组小鼠予等量猴头菇多糖溶液（将粉剂用0.9%氯化钠溶液配置浓度1.1mg/ml）灌胃，均1次/d，连续14d[9]。

1.2.2 T淋巴细胞亚群的检测 末次给药后12h，各组小鼠眼眶取血50μl加入流式管中，并加以4%EDTANa2抗凝，再取PE-CD4-Ab、PE-CD8-Ab各3μl，依次加入流式管中，混匀后避光15min，结束后加入200μl红细胞裂解液，涡轮震荡，再次避光孵育10min，结束后离心3 000r/min，弃上清液，加入500μlPBS，暗室室温下孵育10min，流式细胞仪测定CD4+、CD8+细胞百分比。

1.2.3 血清IL-4水平的测定 末次给药12h后，摘眼球采血0.5ml，按组别装入EP管，肝素抗凝，4℃3 000r/ min离心3min，标本分为血清及血细胞沉淀，取血清，采用ELIAS法，按试剂盒说明书方法操作，酶标仪450nm处检测吸光度A值，绘制出标准曲线，计算IL-4水平。

1.2.4 胸腺指数测量 末次给药12 h后，称量小鼠体重，摘取小鼠胸腺组织，滤纸吸干残血后称重（mg），分别除以小鼠体重，再乘以10，得到小鼠胸腺指数。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表达，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般情况 造模与干预结束后，氢化可的松模型组小鼠可见皮肤松弛，进针处皮肤溃烂，精神萎靡，活动度差，进食差；正常对照组小鼠皮肤紧实，无精神萎靡、进食差等表现；红豆杉多糖低、中、高剂量组及猴头菇多糖阳性对照组小鼠也可见皮肤松弛，但较氢化可的松模型组程度轻，进针处皮肤有溃烂，面积较氢化可的松模型组小，活动度尚可，进食可。

2.2 各组小鼠T淋巴细胞亚群的比较 与正常对照组比较，氢化可的松模型组CD4+、CD8+细胞百分比均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01），说明氢化可的松成功建立免疫低下小鼠的模型。红豆杉多糖高、中、低剂量组及猴头菇阳性对照组CD4+、CD8+细胞百分比均高于氢化可的松模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01），且以中剂量组升高更为显著；红豆杉多糖中剂量组及猴头菇多糖阳性对照组均能降低CD4+/CD8+比值，与氢化可的松模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；红豆杉多糖高、低剂量组与氢化可的松模型组比较CD4+/CD8+比值有降低，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表1。

表1 各组小鼠T淋巴细胞亚群的比较

2.3 各组小鼠血清IL-4水平的比较 与正常对照组比较，氢化可的松模型组血清IL-4水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。红豆杉多糖低、中、高剂量组IL-4水平均高于氢化可的松模型组（P＜0.05或0.01），详见表2。

表2 各组小鼠血清IL-4水平的比较（pg/ml）

2.4 各组小鼠胸腺指数的比较 与正常对照组比较，氢化可的松模型组胸腺指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；猴头菇多糖阳性对照组及红豆杉多糖低、中、高剂量组胸腺指数均高于氢化可的松模型组（P＜0.05或0.01），详见表3。

表3 各组小鼠胸腺指数的比较

3 讨论

免疫器官的重量是反应机体非特异性免疫功能的重要指标，免疫抑制剂可造成机体免疫器官重量下降或者功能低下，而免疫促进剂可使免疫器官的重量恢复正常，胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，从而调节细胞免疫功能。目前胸腺指数成为判断体内细胞免疫水平的一项重要指标[10]。细胞免疫为T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为致敏T细胞，当相同抗原再次进入机体，致敏T细胞对抗原有直接杀伤作用，T细胞所释放的淋巴因子有协同杀伤作用。T淋巴细胞亚群是细胞免疫的主要细胞，可分为细胞毒性T细胞（CD8+T细胞）、辅助性T细胞（CD4+T细胞）和抑制性T细胞。目前发现体内多数细胞因子可通过促进T淋巴细胞亚群的增殖及分化直接增强T细胞介导的细胞免疫反应，还可激活T淋巴细胞亚群分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4等细胞因子增强杀伤性T细胞、NK细胞等的杀伤活性，协同B细胞增殖及分泌抗体，同时在一定程度上可刺激诱导活化的CD4+细胞和CD8+细胞，进一步调节CD4+/CD8+细胞比例，从而起到调节细胞免疫功能的作用[11-12]。故T淋巴细胞亚群的检测分析是判断细胞免疫功能的一个重要方法，正常机体内CD4+细胞和CD8+细胞保持一定的比例，当两者比例失衡，即可产生免疫功能紊乱。

本研究发现，低、中、高剂量红豆杉多糖均能明显提高氢化可的松诱导的免疫功能低下小鼠的胸腺指数水平，其中猴头菇多糖阳性对照组及红豆杉多糖中剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；红豆杉多糖对免疫低下小鼠的CD4+、CD8+淋巴细胞有促进增殖的能力；同时进一步研究发现红豆杉多糖低、中、高剂量组IL-4水平均高于氢化可的松模型组（P＜0.05或0.01），提示红豆杉多糖改善免疫功能低下小鼠细胞免疫功能。

综上所述，红豆杉多糖能提高免疫功能低下小鼠的胸腺指数及IL-4水平，对CD4+、CD8+淋巴细胞有促进增殖的能力，可能是通过调节细胞免疫来增强免疫功能低下小鼠的免疫功能。

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Effects of taxus polysaccharide on cellular immunity of immunosuppressed mice

ZHU Huimin,LI Lulu,CAI Yuanzhen,et al. Department of Geriatric Medicine，Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province,the Second Clinical Medical Conllege of Wenzhou Medical University,Taizhou 318000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of taxus polysaccharide on cellular immunity of immunosuppressed mice. Methods Forty-eight male Kunming mice were divided into 6 groups.Five groups of mice were administered with hydrocortisone (Hy)(0.2mg·kg-1q.o.d x14d s.c)to induce immunosuppression,3 of these groups received taxus polysaccharide treatment (10mg/ml,20mg/ml,40mg/ml),1 group received polysaccharide of hericium erinaceusthe(HEP),1 group received normal saline (NS).Serum CD4+,CD8+levels were detected by flow cytometry,and the thymus index was measured. Results The number of CD4+T cells,CD8+T cells were significantly reduced in Hy-groups compared with normal group,but in high-dose,and middle-dose the number of CD4+T cells,CD8+T cells was significantly increased(P＜0.01),the CD4+/CD8+ratio was decreased in middle dose group compared with model group (P＜0.05).Compared with control group,thymus index was elevated in treatment groups(P＜0.05),which was more markedly in the middle dose group(P＜0.01). Conclusion Taxus polysaccharide can improve the cellular immunity in immunodepressed mice.

Taxus polysaccharide T-lymphocyte Thymus index Mice

2015-12-21）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省台州市科技局科技计划基金（111ky7-2）

318000 台州市中心医院老年医学科,温州医科大学第二临床医学院（朱慧民）；温州医科大学第二临床医学院（李露露）；台州市中心医院老年医学科（陈琪、陈华群、张娅丽）；宁波第七医院心内科（蔡远榛）

朱慧民，E-mail：hkat@163.com