MIB-1、p63在乳腺肿瘤细胞中的表达及意义

周娟娣 谢尚闹 王国良 谢达飞 汤海敏 施宜均 赵福光

MIB-1、p63在乳腺肿瘤细胞中的表达及意义

周娟娣 谢尚闹 王国良 谢达飞 汤海敏 施宜均 赵福光

目的 探讨MIB-1、p63在不同病理类型乳腺肿瘤中的表达及其临床意义。方法 根据WHO（2003）乳腺肿瘤分类标准，收集乳腺肿瘤患者手术切除标本：非典型性增生（ADH）组24例、乳腺原位癌组（DCIS）20例、浸润性癌（IDC）组45例，乳腺普通型增生（UDH）20例作为对照组。应用免疫组化进行MIB-1、p63检测，观察其在不同病理类型乳腺组织中的分布及表达水平。结果

乳腺肿瘤 MIB-1 p63 细胞增殖

乳腺癌的发病率已跃居女性恶性肿瘤首位，而发病机制仍不清楚。近年来，随着分子生物学、免疫组化学，基因工程学等学科技术的发展，有可能对乳腺肿瘤细胞的增值机制进行深入研究，其中MIB-1（ki-67抗原）、p63基因也是目前关注的热点之一。笔者应用免疫组化技术检测MIB-1、p63基因在乳腺不同病理类型中的表达，以探讨其在乳腺肿瘤细胞增殖中的意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2012年05月至2015年11月在我院手术治疗的乳腺肿瘤患者，根据WHO（2003）乳腺肿瘤分类标准[1]分为：非典型性增生（ADH）组24例、导管原位癌（DCIS）组20例及浸润性导管癌（IDC）组45例，研究对象均为女性，术前否认合并其他肿瘤病史，未经过化疗、放疗及免疫治疗，并均经病理确诊。另选取20例普通乳腺上皮增生（UDH）作为对照组。IDC组45例患者年龄23～75岁，中位年龄47岁，其中≥35岁28例，＜35岁17例，按pTNM国际分期标准分为：Ⅰ期10例、Ⅱ期14例、Ⅲ期12例、Ⅵ期9例。合并淋巴转移28例，脉管侵犯6例。乳腺癌组织学分级依照腺管形成、核的多形性及核分裂像多少分为：Ⅰ级5例、Ⅱ级22例、Ⅲ级18例。从手术当日到2015年11月止，对45例IDC患者进行随访，共随访到34例，随访率75.5%，随访时间3～42个月，平均28.6个月。在随访到的患者中死亡3例。各组年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 试剂 即用型MIB-1单克隆抗体及p63单克隆抗体，SP超敏免疫组化染色试剂盒及DAB染色剂，均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 方法 所有手术标本均经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，采用免疫组化EnVision法检测MIB-1、p63在普通上皮增生、非典型增生、原位癌、浸润癌各组中的染色程度，步骤按说明书操作。MIB-1均采用枸橼酸缓冲液高压热力修复抗原，DAB染色，苏木精复染，用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替第一抗体，作为阴性对照。

1.4 结果判断 两人双盲法观察染色切片，参照国内外标准：以阳性细胞数占切片中细胞数5%以上，记（+），阳性细胞数5%～25%为（+）；25%～75%为（++）；＞75%为（+++）；MIB-1在细胞核中表达，阳性染色者细胞核呈棕黄色，MIB-1标记的增殖指数（PI）记数判定标准参照文献[2]。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，变量间的关系采用相关分析Log rank检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MIB-1、p63在乳腺不同病理类型中的表达 MIB-1标记的PI在UDH、ADH、DCIS、IDC组分别为2.25±0.54、4.08±0.57、5.50±0.56、30.22±2.41，从 UDH到 ADH、DCIS，再到IDC组，MIB-1标记的PI显著递增（P＜0.05）。IDC组中MIB-1主要表达于癌细胞核，在癌细胞向间质浸润最明显之处，其表达最强。p63主要在导管周围的肌上皮表达，其表达强度在UDH、ADH、DCIS、IDC中分别为++～+++、++、+、-（表1），随着病变异型性加重，p63阳性表达率明显减低，IDC组与ADH、DCIS组相比差异有统计学意义（P＜0.05），ADH组与DCIS组比较有明显差异（P＜0.01），与UDH组比较无统计学差异（P＞0.05，其阳性染色呈递减）。

表1 p63在乳腺不同病理类型中的表达（例）

2.2 MIB-1在乳腺不同病理类型中染色结果 MIB-1（ki-67抗原）在细胞核中表达，阳性染色者细胞核呈棕黄色，从ADH到DCIS再到IDC，ki-67表达水平逐渐增高，而且在IDC组中MIB-1主要表达于癌细胞核，在癌细胞向间质浸润最明显之处，其表达最强（图1）。

图1 MIB-1在乳腺不同病理类型中染色结果[a：ADH；b：DCIS；c：IDC（30%）；d：IDC（70%）；EnVision染色，×400]

2.3 MIB-1在IDC组表达与临床病理特征的关系 见表2。由表2可见，MIB-1在IDC组表达与病理分期、分子分型有关（P＜0.05），临床分期晚（Ⅲ、Ⅳ期）、分子分型为HER-2型、三阴性患者，其PI均分别显著高于临床分期早（Ⅰ、Ⅱ期）、分子分型为管腔型和正常乳腺细胞型（P＜0.05）的患者，而与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、腋窝淋巴结转移及其个数无关。

表2 MIB-1在IDC组表达与临床病理特征的关系

3 讨论

肿瘤的发生、发展与细胞的异常增殖相关。本组病例着重研究p63、MIB-1在乳腺良性上皮增生向恶性肿瘤细胞发展过程中的基因表达情况，从而探究与乳腺肿瘤细胞增殖的相关性。p63是一种抑癌基因，可表达于多种器官的基底细胞，在乳腺组织中通常只表达于肌上皮，而在乳腺腺上皮、间质肌纤维母细胞和血管平滑肌中不表达[3]。因此文献报道p63在乳腺癌中可作为抑癌基因发挥阻止乳腺癌细胞转移的重要功能[4-5]。本研究结果显示p63在UDH、ADH中呈阳性表达，在DCIS中呈弱阳性表达，而在IDC中呈阴性表达。且随着异型性的增加，阳性度逐渐减弱，IDC与其余各组比较，有统计学差异，ADH与DCIS相比有明显差异，但与UDH比较无统计学差异。这与国外文献报道一致[6]，因此p63蛋白的抗原性较强，是乳腺肌上皮较为敏感和特异的抗体，可以区别良性上皮增生与浸润性导管癌，但不能区分UDH与ADH，Werling等[7]报道了极少数IDC患者仍见局灶状癌细胞表达p63，可能认为表达的癌细胞有基底或上皮细胞分化的倾向。因此p63特别对某些形态学不典型的病例或有分化改变的癌细胞，其表达仍存在一定的假阳性。

MIB-1（ki-67抗原）是一种贯穿表达于增殖细胞中的核抗原，有两种变异体，在维持细胞增殖活动中起重要作用，它存在于细胞周期中除有丝分裂G0期以外的所有阶段，并且在M期达到高峰，由于其半衰期短，可以准确反映细胞的增殖活性，其结果明显优于PCNA指数、DNA指数、DNA倍体含量等表示细胞增殖的指标[8]。因此MIB-1是近年来认为更能有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标记物，已成为检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标[9]。MIB-1可以很好地反映宫颈癌、鼻咽癌、肝癌等细胞增殖情况，目前国内已有不少研究报道，MIB-1表达阳性率高者，其肿瘤恶性程度高，细胞增殖活跃，肿瘤侵袭性强，预后较差。而MIB-1在乳腺癌细胞增殖表达情况研究不多。国外文献报道乳腺癌ki-67表达的高低对评价细胞的增殖状态、癌细胞的复发风险及总体生存率等预后的评估具有重要价值[10]。本组研究结果显示MIB-1标记的PI在UDH、ADH、DCIS、IDC组分别为2.25±0.54，4.08±0.57，5.50±0.56，30.22±2.41，反映出从 UDH到ADH、DCIS，再到IDC，PI显著升高，3者间比较均差异有统计学意义（均P＜0.01），而在IDC中，MIB-1表达与临床病理分期、分子病理分型有关，与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴转移无关。研究结果显示PI与乳腺肿瘤的临床分期呈正相关，随着肿瘤分期增高，ki-67的阳性率明显增高，且各期阳性率差异有统计学意义（P＜0．05）。尽管长期以来临床分期被作为乳腺癌最重要的预后因素，但临床上分期相同的患者，其预后仍不全一样，说明乳腺癌的预后与多种因素相关。本研究还发现，MIB-1的PI与病理分子分型有关，HER-2型、三阴性型的PI高于管腔型A或B患者。这与国外学者报道的文献一致[11]。可见相同临床分期的患者，其预后情况不尽相同，MIB-1可作为同期乳腺癌的预后判断较好的标记物之一，在IDC组MIB-1过度表达者预示癌细胞增殖活跃，更易发生浸润转移，并且可能是癌预后不良的指标[12]。

可见MIB-1随ADH病变到细胞增殖功能的进行性失调，从正常上皮发展到浸润性生长到肿瘤晚期，MIB-1标记指数显著上调；而p63表达呈显著下调，MIB-1过度表达者，乳腺异型增生细胞及癌变细胞的增殖能力均显著增强。有学者报道[13-14]，MIB-1可作为晚期肿瘤放化疗疗效的预测因素，MIB-1高表达者对放化疗敏感性高，其疗效好。另有研究表明ki-67可作为乳腺癌化疗敏感性指标，肿瘤细胞增殖率的降低比肿瘤肿块的缩小更能反映肿瘤对化疗的敏感程度。因此联合检测MIB-1、p63基因不仅可以将乳腺UDH与DCIS、IDC 3者之间进行鉴别，还可以完整地反映乳腺疾病细胞增殖的演变过程及预后判断；动态检测MIB-1还有助于临床医生更精确地分析乳腺癌的高危复发和转移因素，为临床个体化治疗提供理论依据。

[1] Otterbach F,Bankfalvi A,Bergner S,et al.Cytokeratin 5/6 immunohistochemistry assists the differential diagnosis of atypical proliferations ofthe breast[J].Histopathology,2000,37(25):232.

[2] 江忠淸,连成英,林岷,等.宫颈鳞癌组织埃兹蛋白表达与局部浸润转移及预后的关系[J].中华妇幼临床医学杂志,2007,3（6）:308-312.

[3] Barbareschi M,Pecciarini L,Cangi M G,et al.p63,a p53 homologue,is a selective nuclear marker of myoepithelial cells of the human breast[J].Am J Surg pathol,2001,25(8):1054.

[4] D2-40/p63 defined lymphvessel invasion has additional prognostic value in highly proliferating operable node negative breast cancer patients[J].Mod Pathol,2011,24(4):502-11.

[5] Clinical relevance of the putative stem cell marker p63 in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2010,122(3):765-75.

[6] Batistatou A,stefanou D,ArkoumaniE,et al.The usefulness ofp63 as a markerofbreast myoepithelialcells[J].In Vivo,2003,17(6):573.

[7] Werling R W,Hwang H,Ysziji H,et al.Immunohistochemical distinction of invasive from noninvasive breast lesions[J].Am J Surg Pathol,2003,27(1):82.

[8] Duchrow M,Gerdes J,Schluter C,et al.The proliferation associated Ki-67 protein:definition in molecular terms[J].Ceil Prolf, 1994,27(5):235-242.

[9] Hall P A,Levison D A,Woods A L,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunolocalization in paraffin sections:an index of cellproliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms[J].J Pathol,1990,162(4):285-294.

[10] Stuart-Harris R,Caldas C,Pinder S E,et al.Proliferation markers and survival in early breast cancer:a systematic review and meta-analysis of85studies in 32,825 patients[J].Breast,2008,17 (4):323-334.

[11] Niikura N,Masuda S,Kumaki N,et al.Prognostic significance of the Ki67 scoring categories in breast cancer subgroups[J]. Clin Breast Cancer,2014,14(5):323-329.

[12] Saadettin Kilickap,Yalcin Kaya,Birsen Yucel,at al.Higher Ki67 Expression is Associates With Unfavorable Prognostic Factors and Shorter Survival in Breast Cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(3),1381-1385.

[13] Nakano T,Ohno T,Ishikawa H,et al.Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer[J].J Radiat Res, 2010,51(1):l-8.

[14] CabibiD,GiovannelliL,Martorana A,et al.Predictive role of histologicalfeatures and Ki-67 pattern on high-riskHPVpresence in atypicalcervicallesions[J].Histopathology,2007,51(5):713-716.

Significance and expressions of cell proliferation markers(MIB-1 and p63)in Breast carcinoma

ZHOU Juandi，XIE Shangnao，CAI Yuanjie，et al.Department of breastsurgery，Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，China

【 Abstract】 Objective To explore the significance and expressions of cell proliferation markers ((MIB-1 and p63)in the differential diagnosis of benign and malignant breast lesions. Methods experiment group，including atypical duct hyperplasia (ADH,n=24),duct in situ arcinoma(DCIS,n=20)and invasive duct carcinoma(IDC,n=45),were obtained from our department according to the WHO classification of the breast cancer(2003)[1].Usual duct hyperplasia(UDH,n=20)as control group.The immunohistochemical method was performed to detect expressions of MIB-1 and p63. Results In UDH,ADH and DCIS,the expressions of p63 were mainly located in the myoepithelial cells surrounding the glands,There was no deference among ADH and DCIS,In contrast to,UDH,the positive rate for p63 was significantly decreased in ADH and DCIS.In IDC focal positive cells for p63 was seened/t in the any case.The staining reaction of MIB-1 was maily confined to the cellular nucleus the cervical neoplasm.The PI labeled by MIB-1 in UDH,ADH,DICS and IDC groups were 2.25±0.54、4.08±0.57、5.50±0.56 and 30.22± 2.41 respectively.The PI increased remarkably from UDH ADH TO DCIS and then to IDC accordingly(P＜0.05).In contrast to p63 ,the expressions of p63 were reduced remarkably.In IDC,MIB-1-high tumors were significantly associated with advanced stage (Ⅲ-Ⅳ)(P＜0.05)and Triple negative.But there has no something with ages,tumors in size,grade and lymphnode postivity(P＞0.05). Conclusion A panel of myoepithelial markers,including MIB-1 and p63,can be used to differentiate the benign and malignant breast lesions.Else,The level of ki-67 expression was also presented as a progrnostic factor predicting the treatment and risk stratification of breast cancer patients in future.

Breast tumor Proliferating cellMIB-1 p63

2016-05-20）

（本文编辑：田云鹏）

浙江省医药卫生科技一般研究计划项目（2013KYB12）

310012 杭州，浙江医院乳腺外科

周娟娣，E-mail：zjd731@126.com

p63在UDH、ADH、DCIS组中均有不同程度的阳性表达，主要表达于导管周围的肌上皮，ADH、DCIS两组间无明显差异，但与UDH组相比，其阳性表达率明显下降，在IDC组中p63几乎不表达；MIB-1主要表达于增殖细胞中的核抗原，阳性染色定位于肿瘤细胞核，MIB-1标记的增殖指数PI在UDH、ADH、DCIS、IDC组分别为2.25±0.54、4.08±0.57、5.50±0.56、30.22±2.41，从UDH到ADH、DCIS，再到IDC，PI显著升高，p63表达呈逐渐减弱。MIB-1在IDC表达与临床病理分期、分子分型有关，而与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、腋窝淋巴结转移及其个数无关，临床分期越晚（Ⅲ、Ⅳ期）、分子分型为HER-2型、三阴性患者，其PI均分别高于临床分期早（Ⅰ、Ⅱ期）、分子分型为管腔型A或B患者（P＜0.05）。结论 联合检测p63、MIB-1可以较好地反映乳腺增生性病变的程度，正确鉴别乳腺的良恶性病变，通过检测MIB-1的增殖表达水平可预测乳腺恶性肿瘤的浸润程度及整体预后评估。