慢性压迫损伤性神经病理性疼痛大鼠模型中脊髓背角ERK、CREB、BDNF表达的变化

徐良 裘涛 张丽娟 张伟骏

慢性压迫损伤性神经病理性疼痛大鼠模型中脊髓背角ERK、CREB、BDNF表达的变化

徐良 裘涛 张丽娟 张伟骏

目的 通过建立慢性神经结扎性损伤（CCI）大鼠模型，揭示在神经病理性疼痛发生、发展过程中细胞外调节蛋白激酶（ERK）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、脑源性神经营养因子（BDNF）表达的变化。方法 将21只大鼠随机双盲分为模型组、假手术组、U0126组，每组各7只，模型组及U0126组建立CCI模型，假手术组暴露坐骨神经不做结扎，3组均进行鞘内置管，U0126组鞘内注射阻断剂U0126 10μg/次，连续3d；模型组造模成功后、假手术组术后予0.9%氯化钠溶液0.12m l/kg灌胃至术后14d。对各组大鼠分别于术前、术后1、7、14d进行热痛觉过敏行为测试和机械刺激测试，采用Western b lot法检测模型大鼠脊髓背角ERK、CREB、BDNF的表达水平。结果 与假手术组相比，模型组大鼠术后热板及机械缩足反射阈值明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CCI导致大鼠脊髓背角内胞浆与胞核内ERK、CREB、BDNF水平均增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。ERK阻滞剂U0126组能明显升高大鼠术后热板及机械痛敏阈值（P＜0.05），U0126组导致大鼠脊髓背角内胞质与胞核内CREB、BDNF水平均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 CCI模型导致痛觉过敏，U0126可以减轻CCI大鼠的疼痛。ERK-CREB磷酸化的通路参与BDNF对于背根神经节的神经元的保护和修复过程。

脑源性神经营养因子 神经病理性疼痛 细胞外调节蛋白激酶 环磷腺苷效应元件结合蛋白 慢性神经结扎性损伤

【 Abstract】 Objective To investigate the exp ression of extracellular signal-regulated kinase(ERK),cAMP response element binding p rotein(CREB)and brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in spinal cord dorsal horn of ratmodel w ith chronic constriction injury(CCI)-induced neuropathic pain. Methods CCImodelwas induced by chronic nerve ligation in rats. Twenty one rats were random ly divided into model g roup,sham operation g roup and U0126 g roup w ith 7 in each g roup.The thermal hyperalgesia and mechanical stimulation were tested;the exp ressions of ERK,CREB and BDNF p rotein in rat sp inal cord dorsal horn were detected by Western b lot. Results Com pared w ith sham group,model group after the thresholds of thermal hyperalgesia and mechanical stimulation tests were significantly lower(P＜0.05),and the exp ressions of ERK,CREB, and BDNF p rotein were significantly increased(P＜0.01).ERK inhibitor U0126 significantly inc reased the thresholds of thermal hyperalgesia and mechanical stimulation tests(P＜0.05),and also decreased the exp ressions of ERK,CREB and BDNF p rotein in sp inal cord dorsal horn(P＜0.05). Conclusion CCI leads to hyperalgesia in rats,U0126 can reduce the pain in CCI rats, which ind icates that ERK-CREB phosphorylation pathway may be involved in the p rotection and repair of dorsal root gang lion neurons by BDNF.

【 Key words】 Brain-derivedneurotrophic factor Neuropathic pain Extracellular signal-regulated kinase cAMP response elementbinding p rotein Chronic nerve ligation injury

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是与多种周围及中枢神经障碍相关联的一组共同表现症状，是一种创伤或疾病累及躯体感觉系统后直接导致的疼痛。随着分子生物学的发展，研究发现多种伤害性刺激能使细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）在背根神经节和脊髓后角中特异性激活和表达增多，这种传导能被丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）特异性抑制剂所阻断，从而使伤害性刺激所导致的痛觉过敏和异常痛觉明显减弱。E R K不仅通过非转录过程产生短时程功能变化，也通过增加基因转录环磷腺苷效应元件结合蛋（cAMP re s p ons ee l e m e ntbin d in g pr ot e in，CR E B）产生长时程适应性变化，主要由CR E B通过诱导基因转录或通过形成新的突触来完成。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其高结合受体参与了疼痛的形成和维持，可能与MAPK/ERK活化通路有关[1]。笔者建立慢性神经结扎性损伤（chronic constriction jinury，CCI）大鼠模型检测其脊髓背角ERK、CREB、BDNF的表达，旨在揭示BDNF与NP发生、发展及ERK-CREB信号传导途径的关系，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雌性清洁级SD大鼠21只，动物许可证号SCXK（沪）2008-0016，体重200~250g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。U0126（美国GeneOperation公司生产）。低温离心机（德国Heraeus公司），YLS-6B智能热板仪（上海紫一试剂厂），意大利UGO BASILE 37450动态足底触觉仪。BX20型显微镜摄像机（日本OLYMPUS公司）GNP-9080型隔水式恒温培养箱（中国上海精宏医疗设备有限公司）等。

1.2 模型制备与分组 将大鼠放入底部铺有软锯屑垫料的塑料盒中，在安静、温暖、避免强光环境中自由喂养，保证12h明暗交替光照，自由饮食和饮水，适应环境1周后，随机双盲分为假手术组7只和CCI模型组14只，CCI模型组参照文献[2]制作CCI模型，造模成功后进行鞘内置管，再随机双盲分为模型组和U0126组，各7只。假手术组：暴露坐骨神经不做结扎，进行鞘内置管，术后每天给予0.9%氯化钠溶液0.12ml/kg灌胃直至术后14d；U0126组：造模成功后鞘内注射阻断剂U0126 10μg/次，连续3d；模型组：造模成功后每天予0.9%氯化钠溶液0.12ml/kg灌胃直至术后14d。

1.3 鞘内置管 3组大鼠鞘内置管根据Yaksh法[3]进行，大鼠手术后1d观察其活动情况，剔除运动功能障碍的大鼠，评定导管位置是否正确；各组均有1只大鼠鞘内置管失败剔除。术后常规使用青霉素抗感染，分笼单独饲养，室温维持20~25℃，自然照明，自由饮水和摄食。

1.4 行为学测试

1.4.1 一般行为学观察 在术后14d内，连续观察大鼠健康状况以及体重的变化，每日测大鼠体重，每日观察大鼠步态、手术侧后肢的姿势以及局部皮肤和肌肉张力的变化情况，并观察否存在自噬肢体等现象。

1.4.2 热刺激诱发痛行为学测定 打开热板仪，将温度设定到（52±0.2）℃，把大鼠放进玻璃罩内，按下计时开关。当大鼠受刺激缩足时，再按下开关，时间锁定，记录时间。为防止大鼠后足底因反复测量而造成灼伤，设定最长反应时间为20s。当超过20s时，大鼠仍无缩爪反应，设备自动停止检测，数值显示为20s。分别于术前、术后1、7、14d测定5次，取平均值。

1.4.3 机械缩足反射阈值行为学测定 开启电源，设定给力强度最高为50g，将大鼠放入塑料方格中，允许大鼠在铁丝网平台自由活动。待大鼠安静后，将探针对准大鼠患肢足底中部。同时启动按钮，开始计时，当大鼠不能耐受探针逐渐加力而抬脚则停止记录时间。分别于术前、术后1、7、14d测定5次，取平均值。

1.5 标本收集与制备 各组大鼠于术后第14天完成疼痛行为学测定后立即在麻醉下断头处死。取出L4~6脊髓，快速取出脊髓腰膨大段，迅速装入冻存管后放入液氮耀速冻后转移至-80℃冰箱。

1.6 Western blot法测定模型大鼠脊髓背角ERK、CREB及BDNF表达 液氮碾磨标本至粉末状，加入400μl蛋白裂解液，吹散混匀，再震荡器上震荡混匀，然后置冰上30~60min，期间震荡3次。然后在低温离心机中离心，以12 000r/min离心20min，取上清液。加入等量1× SDS样品缓冲液，煮沸10min，冷冻保存。严格按照碧云天产品（SDS-PAGE凝胶配制试剂盒）说明书配胶，待凝固后，蛋白上样，开始电泳，上胶以80V的电压跑，等跑至下胶位置时调电压至100V，直至电泳完成。再转膜，转膜以350~380mA的电流100~20min。转膜后，在5%的BSA中室温封闭2h以上或4℃冰箱过夜，封闭后加一抗（ERK、CREB、BDNF，美国Bioworld Technology公司），以1∶300稀释，4℃冰箱过夜，然后用TBS-T（TBS内加0.05%的吐温-20）洗膜3~5次，加入二抗（sp-9001兔二抗，sp9002鼠二抗，北京中杉公司），以1∶2 000稀释，室温放置2h，TBS-T洗膜3~5次，加入ECL，至于BIO-RAD显影成像分析系统中显影成像存于电脑中，待分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用LSD-t法，方差不齐者采用Games-Howell检验。

2 结果

2.1 3组大鼠一般行为学的变化 各组大鼠造模成功后健康状况良好,体重增加。术后1d CCI大鼠逐步表现出术侧后爪足趾并拢、足底轻度外翻，悬空不愿着地等典型自发痛敏体征。CCI大鼠无自嗜肢体现象发生。假手术组一般情况及行为学表现与术前相同。

2.2 3组大鼠机械缩足反射阈值行为学结果的比较 术前各组大鼠术侧后肢机械刺激缩足反射阈值差异无统计学意义（P＞0.05）；与术前相比，假手术组大鼠各时点术侧后肢机械缩足反射阈值差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，模型组大鼠术后1、7、14d机械缩足反射阈值均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，U1026组大鼠术后7、14d机械缩足反射阈值明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表1。

表1 3组大鼠机械缩足反射阈值行为学结果的比较（g）

2.3 3组大鼠热刺激诱发痛行为学结果的比较 术前各组大鼠术侧后肢热缩足反射潜伏期时间差异无统计学意义（P＞0.05）；与术前相比，假手术组大鼠各时点术侧后肢热缩足反射潜伏期时间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与假手术组相比，模型组大鼠术后1、7、14d术侧后肢热缩足反射潜伏期时间降低,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组相比，U1026组大鼠术7、14d术侧后肢热缩足反射潜伏期时间增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表2。

2.4 3组大鼠Western blot检测结果 与假手术组大鼠相比，CCI导致大鼠脊髓背角内胞浆与胞核内ERK、CREB、BDNF水平均增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与模型组相比，预先鞘内注射U0126组导致大鼠脊髓背角内胞质与胞核内CREB、BDNF水平均明显降低，能明显抑制CCI引起的ERK、CREB和BDNF水平的增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见图1、表3。

图1 E R K、CR E B、B DN F免疫印记条带图

表3 E R K、CR E B、B DN F灰度值

3 讨论

从20世纪70年代开始，人们建立了各种动物模型来模拟NP，从而进一步研究其发病机制，其中基于外周神经损伤的NP模型研究最为广泛，常用的包括CCI、坐骨神经部分结扎模型（partialsciatic nerve ligation，PSNL）、脊神经选择结扎模型（spinal nerve ligation，SNL）和坐骨神经分支选择损伤模型（spared nerve injury，SNI）等[4-5]。CCI模型为Bennett1988年开发出来的一种外周单一神经损伤的动物疼痛模型，其特点是用铬制羊肠线简易的轻度结扎神经，使粗的有髓鞘纤维选择性的损伤，但仍保留大部分传递疼痛的C类纤维。该模型可用机械和热痛阈来检测疼痛相关行为，具有外周和中枢敏化特征，手术操作比较简单，创伤较小，在NP研究中应用最多。

BDNF属于神经营养因子家族[6]，是一类与神经细胞发育、分化、生长、再生和功能有重要调控作用的蛋白，越来越多的研究揭示了分布于中枢和外周神经元的脑源性营养因子及其高结合受体参与了疼痛的形成和维持。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，能够将胞外刺激信号转导成胞内的转录和翻译后效应，主要包括ERK、p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）。早期对MAPKs调节疼痛的研究主要集中在强烈伤害性刺激和炎症的外周神经元机制。多种伤害性刺激能使ERK在背根神经节和脊髓后角中特异性激活和表达增多，这种现象能被MEK特异性抑制剂所明显阻断，并能使明显减弱伤害性刺激所导致的痛觉过敏和异常痛觉，可见MAPK/ERK信号传导通路在疼痛敏化调控方面发挥着重要作用。笔者建立CCI动物模型，通过免疫组化研究发现模型组的脊髓背角BDNF表达阳性细胞表达程度明显减少，这可能是BDNF参与慢性压迫损伤性NP脊髓背角神经元的保护。随着研究工作的逐渐展开和检索大量国内外文献，笔者推测ERK-CREB磷酸化的通路参与BDNF对于背根神经节的神经元的保护和修复过程，从而改变对神经病理性疼痛的产生和维持，为此，笔者通过行为学检测和Western blot检测发现鞘内应用U1026阻断ERK信号传导通路能明显改善由CCI诱发的痛觉过敏，并和BDNF的表达改变有关，由此推断ERK的激活及CREB核内转位参与了NP形成与维持，ERK-CREB、BDNF活化通路有望成为治疗神经病理性疼痛的新靶点，是未来疼痛药物开发的重要方向。

综上所述，笔者立成功构建CCI动物模型，通过行为学检测和Western blot检测发现鞘内应用U1026阻断ERK信号传导通路能明显改善由CCI诱发的痛觉过敏，导致大鼠脊髓背角内胞浆与胞核内CREB、BDNF水平均明显降低。当然，本实验样本量比较小，导致实验的个体差异可能会对实验结果有一定影响。

[1]Lang B C,Zhang Z,Lv L Y,et al.OECs transp lantation results in neuropathic painassociated with BDNF regulating ERK activity in rats follow ing cord hem isection[J].Bm c Neuroscience,2013,14 (3)：1-10.

[2]Bennett G J,Xie Y K.A peripheral mononeuropathy in rat that p roduces d isorder of pain sensation like those seen in man[J]. Pain,1988,33：87-107.

[3]宋宗斌,郭曲练,邹望远,等.不同类型导管用于大鼠改良Yaksh法鞘内置管的比较[J].中国比较医学杂志,2009,11(19)：59-62.

[4]IYalcin,YBohren,EWaltisperger,etal.A time-dependenthistory of mood d isorders in a m urine mode l of neuropathic pain[J]. BiologicalPsychiatry,2011,70(10)：946-953.

[5]RuangsriS,Lin A,MulpuriY,etal.Relationship ofaxonalvoltagegated sod ium channel1.8(NaV1.8)mRNA accumu lation to sciatic nerve injury-induced painful neuropathy in rats[J].Journal of BiologicalChem istry,2011,286(46)：39836-39847.

[6]Alm eida C,Demam an A,Kusuda R,et al.Exercise therapy norm alizes BDNF up regu lation and g lialhyperactivity in a mouse m odelofneuropathic pain[J].Pain,2015,156(3)：504-513.

Expression of ERK,CREB and BDNF in spinal cord dorsal horn of rat model w ith chronic constriction injury-induced neuropathic pain

XU Liang,QIU Tao,ZHANG Lijuan,et al.Department of Intensive Care Unit,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

2015-12-09）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省卫生厅项目（2013KYA139）；浙江中医药管理局项目（2014Z B039）；浙江中医药科技计划项目（2016Z B015）

310014 杭州，浙江省人民医院重症医学科（徐良）；浙江中医药大学附属第一医院神经内科（裘涛、张伟骏）；武警浙江总队杭州医院神经内科（张丽娟）

张伟骏，E-mail：sus an7888@163.com