花生四烯酸细胞色素P450酶代谢通路基因多态性与脑梗死发病的相关性研究

陈义明 余泽珍 周强 李强 池丽芬 易兴阳

花生四烯酸细胞色素P450酶代谢通路基因多态性与脑梗死发病的相关性研究

陈义明 余泽珍 周强 李强 池丽芬 易兴阳

目的 探讨花生四烯酸（AA）细胞色素P450酶（CYP）代谢通路基因多态性及基因-基因交互作用与脑梗死发病的相关性。方法 选择经头颅CT和/或MRI检查确诊、起病72h内入院、首次发病的脑梗死患者300例为病例组，同期健康体检者298例为对照组。应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）检测CYP2C8基因rs17110453、rs1934980，CYP2J2基因rs10889160，CYP4A11基因rs2269231、rs9333025和CYP4F2基因rs3093135的单核苷酸多态性（SNP），应用广义多因子降维法（GMDR）检测基因-基因交互作用。结果 单基因分析发现，两组间6个基因位点的基因型分布差异均无统计学意义（均P＞0.05）。GMDR分析发现，rs17110453和rs9333025两个基因位点具有交互作用，最优模型为rs17110453和rs9333025两个基因位点联合作用模型，交叉检验一致性为10/10，符号检验为9（P=0.011 2）；交互作用风险较大的组合依次为rs17110453CC+ rs9333025GG、rs17110453 CC+rs9333025GG/AG、rs17110453CC+rs9333025AG。多因素logistic回归分析发现调整年龄、高血压、糖尿病因素后，rs17110453和rs9333025的高风险交互变量与脑梗死发病风险相关（OR=2.96，95%CI：1.58～8.26，P=0.000）。结论rs17110453和rs9333025两基因位点联合交互作用可明显增加脑梗死发病的风险。

花生四烯酸 细胞色素P450酶 单核苷酸多态性 脑梗死 相关性

【 Abstract】 Objective To investigate the association of single nucleotide polymorphisms(SNP)in arachidonic acid(AA) cytochrome P450(CYP)pathway genes with the risk of cerebral infarction(CI). Methods Three hundred patients with CI and 298 health subjects were enrolled in the study.CYP2C8 rs17110453,CYP2C8 rs1934980,CYP2J2 rs10889160,CYP4A11 rs2269231, CYP4A11 rs9333025 and CYP4F2 rs3093135 genes SNP were examined using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)method.Gene-gene interactions were analyzed using generalized multifactor dimensionality reduction(GMDR)methods. Results Single gene variant analysis found that there were no significant differences in genotype distributions between patients and controls.However,GMDR analysis showed a significant gene-gene interaction between rs17110453 and rs9333025 with a score of 10/10 for the cross-validation consistency and 9 for sign test(P=0.0112). Patients with combination of rs17110453CC+rs9333025GG,rs17110453CC+rs9333025GG/AG,rs17110453 CC+rs9333025AG had a significantly higher risk for CI.Logistic regression analysis showed that the high-risk interactive genotypes among rs17110453 and rs9333025 were independent risk factors of CI after adjustment for age,hypertension and diabetes mellitus factors (OR=2.96,95%CI:1.58-8.26,P=0.000). Conclusion The interaction of two gene-loci rs17110453 and rs9333025 significantly increases the risk of CI.

【 Key words】 Arachidonic acid Cytochrome P450 enzyme Single nucleotide polymorphism Cerebral infarction Correlation

脑梗死是由多种病因和发病机制构成的一组综合征。即使在良好控制高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟等传统危险因素的情况下，部分患者仍不可避免发生或复发脑梗死，提示脑梗死的发病可能与个体的遗传易感性有关。花生四烯酸（AA）在细胞色素P450酶（CYP）代谢通路的代谢产物与脑梗死发病密切相关，国内外已有较多相关报道，但研究结果差异较大[1-10]。而本文通过病例对照来探讨中国人群CYP代谢通路基因多态性以及基因-基因交互作用与脑梗死发病的相关性，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 根据基因-基因交互作用样本量计算方法[11]，假设有基因-基因交互作用者和无交互作用者CI差异率5%，计算出脑梗死患者和对照者各290例能提供80%的检验效能。故本研究选择脑梗死患者300例、对照者298例以满足该检验效能。选择2012年9月至2014年8月起病、72h内入住温州医科大学附属第三医院、首次发病的脑梗死患者300例为病例组，其中男164例，女136例；年龄40～90（69.12±11.13）岁；均经头颅CT和/或MRI检查确诊；病因学分型包括动脉粥样硬化血栓型（AT）和小动脉病变型（SAD）脑梗死[12]；均无血缘关系。排除标准：（1）心源性脑栓塞、其他病因的脑梗死、病因不明确的脑梗死患者；（2）既往有卒中史者；（3）伴有其他遗传病者。选择同期同一家医院健康体检的志愿者298例为对照组，其中男163例，女135例；年龄40～89（63.89±10.42）岁；经病史、体检及头部CT检查证实无颅内病变，无脑血管病家族史，无遗传病史，无血缘关系。本研究经温州医科大学附属第三医院伦理委员会审查批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 危险因素的评估 评估所有研究对象的传统危险因素，包括既往病史、个人史和常见危险因素（吸烟、酗酒，高血压、糖尿病、冠心病患病情况，脑卒中史，血常规、凝血功能、血生化等检查结果）。

1.2.2 研究基因位点的选择 参考国外研究位点，并登录NCBI数据库最新登记的各基因人类单核苷酸多态性（SNP，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP），查找标签SNP（http://www.hapmap.org），设置最小等位基因频率（MAP）≥0.05，获得各基因的标签SNP，即本研究各基因研究的位点。据此确定以下4个基因6个检测位点：CYP2C8基因rs17110453，rs1934980；CYP2J2基因rs10889160；CYP4A11基因rs2269231，rs9333025；CYP4F2基因rs3093135。

1.2.3 血标本采集与DNA制备 清晨采集空腹静脉血3ml，EDTA抗凝，分离血浆。采用Axyprep-96全血基因组DNA试剂盒（美国AXYGEN公司）提取DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳观察结果，标化DNA浓度值为5mg/L，-80℃保存。

表1 每个SNP基因型的扩增和延长引物

1.2.4 CYP代谢通路调控基因SNP检测 委托上海生工生物工程股份有限公司，采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测技术[13]（美国Sequenom公司）对上述4个基因6个位点SNP进行检测分型。通过PCR扩增第1个靶序列，然后加入特异性延伸产物将扩增的片段SNP连接。参照基因文库GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/），利用Mass ARRAY Assay Design 2.0软件（美国Sequenom公司），选择每个基因上符合条件的SNP设计多重PCR引物（美国Sequenom公司），见表1。检测步骤包括多重PCR扩增、碱性磷酸酶纯化、延伸反应、树脂纯化、点样芯片和质谱检测；此外，对部分基因位点的PCR产物片段进行2%琼脂糖凝胶电泳检测与鉴定。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。基因频率采用基因计数法，用χ2拟合优度检验Hardy-Weinberg平衡，病例组与对照者等位基因和基因型的频率分布比较采用χ2检验；计量资料用表示，组间比较采用t检验。应用广义多因子降维法（GMDR）Beta V 0.7软件计算基因-基因交互作用与脑梗死的相关性[13]；采用多因素logistic回归调整传统危险因素的影响，计算基因-基因交互作用、等位基因和基因型与脑梗死发病的相对风险率，用OR值及95%CI表示。

2 结果

2.1 病例组与对照组危险因素比较 病例组高血压、糖尿病患病率为75.0%、35.6%，分别高于对照组的28.3%、27.5%（均P＜0.05）。两组高脂血症患病率、吸烟发生率、酗酒发生率分别为19.0%、43.3%、43.3%和 23.8%、40.3%、43.0%，两组TC、LDL-C、HDL-C和TG分别为（4.879±1.655）、（3.046±1.329）、（1.168±0.660）、（1.794±1.102）mmol/L和（4.893±1.032）、（2.947±0.484）、（1.848±1.107）mmol/L，两组PLT分别为（190.2±162.3）× 109/L和（197.7±54.2）×109/L，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 病例组与对照组基因型分布的比较 两组中6个基因位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。等位基因与基因型的观察值、期望值吻合良好。单个基因分析发现，两组间6个基因位点各基因型比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。分层分析发现，6个基因位点各基因型在不同病因学分型，不同年龄分组（65岁为界），有无高血压、糖尿病方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 病例组和对照组基因型分布的比较[例（%）]

2.3 基因-基因交互作用与脑梗死发病的相关性 用GMDR分析基因-基因交互作用与脑梗死发病的相关性，最优模型为rs17110453和rs9333025两个基因位点联合作用模型，交叉检验一致性为10/10，符号检验为9（P=0.011 2），见表3。

表3 基因-基因交互作用与脑梗死发病的相关性的GMDR模型分析

用GMDR得出最优模型后，再用logistic回归评估rs17110453和rs9333025两个基因位点9种基因型组合与脑梗死发病的相对风险。结果表明交互作用风险较大的组合依次为rs17110453CC+rs9333025GG、 rs17110453CC+rs9333025GG/AG、rs17110453CC+ rs9333025AG，见表4。

2.4 影响脑梗死发病的多因素logistic回归分析 根据表4结果，将rs17110453和rs9333025两个基因位点9种基因型组合设为交互变量，分为高危、低危2类（高危=1，低危=0）。调整年龄、高血压、糖尿病因素后，多因素logistic回归分析结果显示rs17110453和rs9333025的高风险交互变量与脑梗死发病风险呈正相关（OR= 2.96，95%CI：1.58～8.26，P=0.000），见表5。

表4 rs17110453和rs9333025各种基因型组合与脑梗死发病的相关性

3 讨论

AA是人体内多种重要心脑血管活性物质的前体，AA代谢产物与脑梗死发病密切相关[1]。国内外相关研究结论差异较大：国内学者Yi等[13]通过对CYP代谢通路10个基因位点进行研究，未发现单个基因位点多态性与脑梗死发病风险相关；日本Fu等[2，5]研究结果表明CYP4F2基因rs3093135多态性与脑梗死发病无相关性，但CYP4A11基因rs9333025的GG基因型与日本男性脑梗死发病的风险有关；Fava等[3]研究表明瑞典人群CYP4A11基因F434S和 CYP4F2基因V433M的SNP是独立于高血压外、与男性脑梗死发病相关的危险因素。Ding等[4]发现CYP4F2基因V433M会增加男性缺血性中风的发病率；Fava等[6]研究发现瑞典人群CYP2J2基因50G＞T（rs890293）与脑缺血性事件无明显相关性；美国Marciante等[7]研究发现CYP2J2基因rs10889160、rs11572325与脑梗死发病无关；Zhang等[8]研究发现中国汉族人群的CYP2J2-50T等位基因与脑缺血性事件无明显相关性；Kaur-Knudsen等[9]、Chi等[10]研究显示 CYP2C9（*）2（rs1799853）、CYP2C9（*）3（rs1057910）和CYP2C8基因多态性与缺血性心脑血管病发病无相关性。造成以上研究结果差异较大的原因可能如下：（1）研究对象的种族和纳入标准不同、样本量不一、研究基因位点少等；（2）脑梗死是多基因遗传的复杂疾病，并不遵从孟德尔遗传模式，单个基因效应微弱或不显示效应，因此单基因连锁分析对多基因遗传的疾病进行研究并不适合[13]。

本研究对病例组与对照组CYP代谢通路4个基因6个位点的多态性进行分析，发现两组间6个基因位点的基因型分布差异均无统计学意义，即未发现单个基因位点与脑梗死发病风险独立相关。GMDR分析发现这6个基因位点间存在交互作用，最优模型为rs17110453和rs9333025两个基因位点联合作用模型，rs17110453和rs9333025的高风险交互与脑梗死发病风险相关，OR=2.96，95%CI：1.58～2.96。

目前就rs17110453和rs9333025两个基因位点交互作用会增加脑梗死发病风险的机制尚未清楚，可能与这两个基因位点以相互拮抗的方式调控AA代谢有关。rs17110453编码CYP2C8酶的活性，CYP2C8作为一种CYP表氧化酶，能够转化AA生成环氧二十碳三烯酸（EETs）[13]，而EETs具有舒张血管、调节离子通道、抗血小板集聚、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用，EETs再经可溶性环氧化物水解酶（sEH）作用下水解生成生物活性较弱的二羟基二十碳三烯酸（DHETs）。rs9333025编码CYP4A11的活性，CYP4A11作为一种CYP羟化酶，能够转化AA生成19-羟基二十碳四烯酸（HETEs）和20-HETEs发病风险，HETEs具有缩血管、损伤血管内皮功能、促动脉粥样硬化等作用[12,14]。因此，rs17110453和rs9333025两个基因位点交互作用可使循环中EETs水平降低和HETEs水平增高，AA代谢的动态平衡破坏，交互作用下可能导致动脉粥样病变，进而增加脑梗死发病风险[12]。

[1] Ward N C,Croft K D,Blacker D,et al.Cytochrome P450 metabolites of arachidonic acid are elevated in stroke patients compared with healthy controls[J].Clin Sci(Lond),2011(121): 501-507.

[2] Fu Z,Nakayama T,Sato N,et al.Haplotype-based case studyof human CYP4A11 gene and cerebral infarction in Japanese subject[J].Endocrine,2008,33(2):215-222.

[3] Fava C,Montagnana M,Almgren P,et al.The V433M variant of the CYP4F2 is associated with ischemic stroke in male Swedes beyond its effect on blood pressure[J].Hypertension,2008,52 (2):373-380.

[4] Ding H,Cui G,Zhang L,et al.Association of common variants of CYP4A11 and CYP4F2 with stroke in the Han Chinese population [J].Pharmcogenet Genomics,2010,20(3):187-194.

[5] Fu Z,Nakayama T,Sato N,et al.A haplotype of the CYP4F2 gene is associated with cerebral infarction in Japanese men[J]. Am J Hypertens,2008,21(11):1216-1223.

[6] Fava C,Montagnana M,Almgren P,et al.The common functional polymorphism-50G＞T of the CYP2J2 gene is not associated with ischemic coronary and cerebrovascular events in an urbanbased sample of Swedes[J].J Hypertens,2010,28(2):294-299.

[7] Marciante K D,Totah R A,Heckbert S R,et al.Common variation in cytochrome P450 epoxygenase genes and the risk of incident nonfatal myocardial infarction and ischemic stroke[J].Pharmacogenet Genomics,2008,18(6):535-543.

[8] Zhang L,Ding H,Yan J,et al.Genetic variation in cytochrome P450 2J2 and soluble epoxide hydrolase and risk of ischemic stroke in a Chinese population[J].Pharmacogenet Genomics, 2008,18(1):45-51.

[9] Kaur-Knudsen D,Bojesen S E,Nordestgaard B G.Common polymorphisms in CYP2C9,subclinical atherosclerosis and risk of ischemic vascular disease in 52000 individuals[J].Pharmacogenomics J,2009,9(5):327-332.

[10] Chi L F,Yi X Y,Shao M J,et al.Interaction between ALOX5AP and CYP3A5 gene variants significantly increases the risk for cerebralinfarctions in Chinese[J].Neuroreport,2014,25(7):452-457.

[11] Wang S,Zhao H.Sample size needed to detect gene-gene interactions using association designs[J].Am J Epidemiol,2003 (158):899-914.

[12] Yi X,Liao D,Fu X,et al.Interaction among CYP2C8,EPHX2, and CYP4A11 Gene Variants Significantly Increases the Risk for Ischemic Stroke in Chinese Populations[J].J Atheroscler Thromb,2015(22):1148-1157.

[13] Yi X,Zhang B,Wang C,et al.Genetic polymorphisms of ALOX5AP and CYP3A5 increase susceptibility to ischemic stroke and are associated with atherothrombotic events in stroke patients[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2015,24(3):521-529.

[14] Liao D,Yi X,Zhang B,et al.Interaction Between CYP4F2 rs2108622 and CPY4A11 rs9333025 Variants Is Significantly Correlated with Susceptibility to Ischemic Stroke and 20-Hydroxyeicosatetraenoic Acid Level[J].Genet Test Mol Biomarkers,2016,20(5):223-228.

Association ofpolymorphismsin arachidonic acid cytochrome P450 metabolic pathway geneswith susceptibility ofcerebral infarction

CHEN Yiming，YU Zezhen，ZHOU Qiang，et al.Department of General Internal Medicine,the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325200，China

2016-01-10）

（本文编辑：陈丹）

325200 温州医科大学附属第三医院普内科（陈义明），体检中心（余泽珍），神经内科（周强、池丽芬），检验科（李强）；四川省德阳市人民医院神经内科（易兴阳）

陈义明，E-mail：chenym579@163.com