甲状旁腺激素和骨硬化蛋白抗体联合治疗雌性SD大鼠骨质疏松症的疗效观察

陈欣 潘月好 金国华 楼舒畅

甲状旁腺激素和骨硬化蛋白抗体联合治疗雌性SD大鼠骨质疏松症的疗效观察

陈欣 潘月好 金国华 楼舒畅

目的 探索甲状旁腺激素（PTH）和骨硬化蛋白抗体（Scl-Ab）联合治疗雌性SD大鼠骨质疏松症的疗效，为临床应用提供实验基础。方法 从70只健康雌性SD大鼠随机选取65只行双侧卵巢切除术，其余5只行假手术；术后在正常环境下饲养12周，从双侧卵巢切除大鼠中随机选取5只检测胫骨骨密度，较假手术大鼠下降37.64%，证实骨质疏松大鼠模型建立成功。遂将余下60只双侧卵巢切除大鼠随机分成4组：未用药组15只（其中2只大鼠因伤口感染而死亡）、Scl-Ab组15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周）、PTH组15只（PTH 60μg/kg皮下注射，3次/周）、PTH+Scl-Ab组15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周；同时PTH 60μg/kg皮下注射，3次/周）。治疗12周后处死大鼠取胫骨行Micro-CT、HE组织切片和骨生物力学检测与比较。结果Micro-CT三维重建分析，药物治疗12周后Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组骨小梁数量较未用药组明显增多，且骨小梁更粗、联系更为紧密；胫骨干骺端微观参数改善较未用药组更为明显，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中PTH+Scl-Ab组最为明显（P＜0.05）。HE组织切片可见Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组骨小梁之间联系紧密，排列规律，且胫骨干骺端骨量增加，胫骨局部骨组织矿化明显，其中PTH+Scl-Ab组最为明显。骨生物力学检测结果显示Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组最大载荷、刚度值均高于未用药组（均P＜0.05），其中PTH+Scl-Ab组亦分别高于Scl-Ab组和PTH组（均P＜0.05）。结论 PTH、Scl-Ab治疗雌性SD大鼠骨质疏松症的疗效明显，其中两药联用疗效更佳。

去势大鼠 骨质疏松症 甲状旁腺激素 骨硬化蛋白抗体

随着人类寿命的延长和社会老龄化的进展，骨质疏松症引起的骨折大大增加了老年人病残率和病死率，明显加重了社会公共卫生的经济负担[1]，如何防治骨质疏松症是临床医师不可忽视的问题。随着研究的深入，学者们对抗骨质疏松药物提出了一种新要求——强烈刺激成骨作用、增加骨量、抑制骨吸收的活性[2]。甲状旁腺激素（PTH）是在钙盐沉积以及骨形成过程中的重要调节因素，间断使用可促进骨质形成、预防骨折发生。相关研究表明间歇性给药可以作用于四肢骨中的骨小梁以及密质骨表面，刺激成骨细胞增殖，抑制成骨细胞凋亡，激活衬里细胞，从而促进骨质形成[3]。有研究发现骨硬化蛋白（sclerostin，Scl）经Wnt通路负向调节骨代谢的作用是引起骨质疏松症的原因之一[4]，而骨硬化蛋白抗体（Scl-Ab）可拮抗该负向调节作用，抑制骨丢失并促进骨生成[5]。为了进一步研究PTH和Scl-Ab用于临床防治骨质疏松症的可能性，笔者建立骨质疏松大鼠模型，经PTH、Scl-Ab和PTH+Scl-Ab治疗后观察疗效，为临床推广应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料 （1）实验动物：12周龄SPF级SD雌性大鼠70只，体重225～250g，由上海斯莱克动物公司提供[许可证号：SCXK（沪）2007-0005，合格证号：2007-000548429]。所有大鼠在温度（24±0.5）℃、湿度45%～ 50%、通风良好的环境下饲养，每周称重1次。所有大鼠每次手术后3d给予青霉素肌肉注射（2.5万U/kg）以预防感染。（2）材料和仪器：Scl-Ab（美国MSD公司）；PTH（美国GIBCO公司）；Micro-CT（Sky Scan 1176，荷兰），显微镜（Axio Imager M1，德国ZEISS公司），Image-Pro Plus全自动图像分析仪（美国Media Cybernetics公司），生物力学实验机（MTS-858 Mini Bionix，美国）。

1.2 方法

1.2.1 骨质疏松大鼠模型的建立 70只大鼠中随机取65只行双侧卵巢切除术，余下5只作为假手术对照（仅作切口显露卵巢脂肪包被组织后缝合，不切除双侧卵巢）。（1）双侧卵巢切除术：按照3ml/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉；在大鼠背部正中线中下1/3处作一长约2cm的纵行切口，向两侧钝性分离皮下软组织，于脊柱旁开0.5cm处钝性分离肌肉组织，显露卵巢脂肪包被组织；轻轻提起卵巢，在输卵管卵巢交界处丝线结扎，完整摘除双侧卵巢，逐层缝合，关闭创口。（2）骨质疏松大鼠模型的检验：70只大鼠在正常环境下饲养12周，从双侧卵巢切除的大鼠中随机选取5只大鼠处死，使用骨密度测量仪检测胫骨骨密度，以假手术大鼠为对照，胫骨骨密度下降37.64%（＞30%），证实骨质疏松大鼠模型建立成功。

1.2.2 分组及治疗 将余下60只双侧卵巢切除的大鼠随机分成4组：未用药组15只（其中2只大鼠因伤口感染而死亡）、Scl-Ab组15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周）、PTH组15只（60μg/kg皮下注射，3次/周）、PTH+Scl-Ab组15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周；同时PTH 60μg/kg皮下注射，3次/周）。药物治疗12周后，处死所有存活大鼠，完整取下大鼠双侧胫骨行Micro-CT、HE组织切片、骨生物力学检测。

1.2.3 Micro-CT检测 取左侧胫骨，剔除周围软组织后用0.9%氯化钠溶液冲洗，使用10%的多聚甲醛固定进行Micro-CT检测。扫描条件：图像矩阵为2 048×2 048，整合时间为200ms，能量/强度70kVp、114μA、8W。以0°旋转，进行扫描。扫描完成后，选取生长板远端1.0mm、层厚2.0mm的骨组织为松质骨感兴趣区域（region of interest，ROI）进行三维重组，最低阈值为160提取图像信息。获得大鼠胫骨干骺端ROI骨微结构参数骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb Th）、骨小梁数量（Tb N）、骨小梁分离度（Tb Sp）、连接密度（Conn D）和骨密度（BMD）。

1.2.4 HE组织切片 待左侧胫骨标本完成Micro-CT检测后，用4%多聚甲醛固定，EDTA脱钙液中浸泡，每3～4d换液1次，连续脱钙4周后进行X线摄片检查是否脱钙完全，然后充分水洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色。不脱钙骨组织包埋块修整后置于硬组织切片机沿胫骨纵轴冠状面切片，清洗打磨抛光，切片最终厚度30～40μm，置于荧光显微镜及光镜下观察。使用Image-Pro Plus 6.0全自动图像分析仪计算骨矿化沉积率。

1.2.5 骨生物力学测定 取右侧胫骨并置于MTS-858型生物力学实验机上，支点跨距17mm，中点为加压点，加载速度为2mm/min，计算机记录载荷-位移曲线，根据曲线计算最大载荷和刚度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料用表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 Micro-CT三维重建分析 通过Micro-CT对大鼠左侧胫骨干骺端ROI进行三维重建，可见Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组骨小梁数量较未用药组明显增多，且骨小梁更粗、联系更为紧密，见图1。

2.2 4组大鼠左侧胫骨干骺端微观参数比较 药物治疗12周后，与未用药组比较，Scl-Ab、PTH、PTH+Scl-Ab组大鼠胫骨干骺端微观参数均明显改善（其中BMD分别较未用药组增加了19.09%、28.62%和39.26%），差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与PTH组、Scl-Ab组比较，PTH+Scl-Ab组胫骨干骺端微观参数改善更为明显，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

图1 4组大鼠用药12周后左侧胫骨干骺端ROI Micro-CT三维重建结果（a：未用药组；b：Scl-Ab组；c：PTH组；d：PTH+Scl-Ab组）

表1 4组大鼠用药12周后左侧胫骨干骺端微观参数比较

2.3 4组大鼠左侧胫骨HE组织切片所见比较 由图2可见Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组骨小梁之间联系紧密，排列规律，且胫骨干骺端骨量高于未用药组；未用药组骨小梁稀疏、纤细，部分出现断裂。由图3可见，与未用药组比较，Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组大鼠胫骨局部骨组织矿化明显，其中PTH+Scl-Ab组最为明显。

图2 4组大鼠用药12周后左侧胫骨干骺端HE组织切片所见（a：未用药组；b：Scl-Ab组；c：PTH组；d：PTH+Scl-Ab组）

图3 4组大鼠用药12周后左侧胫骨干骺端骨矿化情况（a：未用药组；b：Scl-Ab组；c：PTH组；d：PTH+Scl-Ab组）

2.4 4组大鼠右侧胫骨骨生物力学检测结果比较 Scl-Ab组、PTH组和PTH+Scl-Ab组最大载荷、刚度值均高于未用药组（均P＜0.05），其中PTH+Scl-Ab组最大载荷、刚度值分别高于Scl-Ab组和PTH组（均P＜0.05），见表2。

表2 4组大鼠用药12周后右侧胫骨骨生物力学检测结果

3 讨论

骨质疏松症是一种以骨量降低、骨组织结构发生退变的骨骼疾病，会使骨脆性增加，骨强度下降，从而导致骨折[6]。随着全球老龄化的进展，骨质疏松症患病率不断升高，骨质疏松症引起的骨折已成为全球难题，如何防治骨质疏松症成为临床医生面临的一项巨大挑战[7]。目前抗骨质疏松药物主要有二膦酸盐类、地诺单抗、雌激素等，临床治疗效果均可，但亦存在一些不利因素，如人体对二膦酸盐类的吸收率低，不适用于有血栓栓塞性疾病或肾功能不全者[8]；使用地诺单抗时易出现下颌骨坏死[9]；雌激素的使用会增加妇科肿瘤发病率。间歇性小剂量使用PTH具有促进骨合成代谢、改善骨微结构、增加骨量的作用；本实验结果证实骨质疏松大鼠经PTH治疗12周后胫骨干骺端微观参数明显改善，骨量增加，与未用药组比较差异均有统计学意义。而Scl-Ab可以负向调控骨形态发生蛋白活动[10]，亦可与Wnt通路共受体，与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6结合，从而调控骨的生长[11]。Scl-Ab可以特异性拮抗Scl的活性来影响骨代谢[12]，在刺激成骨活动的同时又不会刺激破骨活动，即其对骨合成代谢具有明显刺激作用[13]；此外，Scl-Ab可以降低骨溶解标志物血清C端肽水平，具有抑制骨分解的作用[14]。本实验结果证实Scl-Ab可以明显增加大鼠胫骨干骺端骨量，加速骨组织矿化，提高骨强度，与未用药组比较差异均有统计学意义。

本实验使用雌性SD大鼠切除双侧卵巢12周来建立骨质疏松模型，通过使用PTH和Scl-Ab来改变双侧卵巢切除大鼠的骨代谢，经药物治疗12周后处死大鼠取双侧股骨行Micro-CT、HE组织切片、骨生物力学检测。实验结果表明相对于未使用药物、单独使用PTH或Scl-Ab，PTH+Scl-Ab联合使用更能明显增加胫骨BMD，提高胫骨干骺端微观参数，保护骨小梁的质和量，加速骨组织矿化，增加胫骨最大载荷和刚度值；提示联合使用PTH和Scl-Ab在骨质疏松症治疗中具有互相促进、叠加治疗的作用。目前具体机制尚未清楚，可能与两者促进骨形成的机制有关。PTH具有强烈促进成骨作用的同时增强破骨细胞活性，而Scl-Ab具有抑制破骨细胞的作用但又不影响PTH成骨作用，这与PTH和二膦酸盐类联合使用不同，二膦酸盐类抑制破骨细胞活性的同时会影响PTH的成骨效果；而Scl-Ab抑制骨吸收且不影响到破骨细胞活性[12]，可增加骨形成，因此不会影响PTH的作用，从而说明PTH和Scl-Ab联合使用具有叠加治疗的作用。

本次实验从体外证实了联合使用PTH和Scl-Ab治疗雌性SD大鼠骨质疏松症的疗效明显，为其在临床推广使用提供了实验基础。但是人体环境复杂，仍需进一步研究。

[1] Ishtiaq S,Fogelman I,Hampson G.Treatment ofpost-menopausal osteoporosis:beyond bisphosphonates[J].Journal of EndocrinologicalInvestigation,2015,38(1):13-29.

[2] Cairoli E,Zhukouskaya VV,Eller-Vainicher C,et al.Perspectives on osteoporosis therapies[J].Journal of Endocrinological Investigation,2015,38(3):303-311.

[3] Compston J E.Skeletal actions of intermittent parathyroid hormone:effects on bone remodelling and structure[J].Bone,2007, 40(6):1447-1452.

[4] H C.Wnt/beta-catenin signaling in development and disease[J]. Cell,2006,127(3):469-480.

[5] Viaene L,Behets G J,Claes K,et al.Sclerostin:another bone-related protein related to all-cause mortality in haemodialysis?[J]. Nephrology Dialysis Transplantation,2013,28(12):3024-3030.

[6] Kawate H,Takayanagi R.Efficacy and safety of bazedoxifene for postmenopausal osteoporosis[J].Clinical Interventions in Aging, 2010,6(1):151-160.

[7] Burge R,Dawson-hughes B,Solomon D H,et al.Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States,2005-2025[J].Journal of Bone&Mineral Research,2007, 22(3):465-475.

[8] Warriner A H,Saag K G.Osteoporosis diagnosis and medical treatment[J].Orthopedic Clinics of North America,2013,44(2): 125-135.

[9] Yee A J,Raje N S.Denosumab,a RANK ligand inhibitor,for the management of bone loss in cancer patients[J].ClinicalInterventions in Aging,2012,7(12):331-338.

[10] Moester MJ C,Papapoulos S E,Lo wik C WG M,et al.Sclerostin: current knowledge and future perspectives[J].Calcified Tissue International,2010,87(2):99-107.

[11] Ellies D L,Viviano B,Mccarthy J,et al.Bone density ligand,sclerostin,directly interacts with LRP5 but not LRP5G171Vto modu-late wnt activity[J].JournalofBone&MineralResearch,2006,21 (21):1738-1749.

[12] Gamie Z,Korres N,Leonidou A,et al.Sclerostin monoclonal antibodies on bone metabolism and fracture healing[J].Expert Opinion on InvestigationalDrugs,2012,21(10):1523-1534.

[13] Okazaki R.Anti-sclerostin antibodies[J].Clinical Calcium,2011, 21(1):94-98.

[14] Padhi D,Jang G,Stouch B,et al.Single-dose,placebo-controlled,randomized study of AMG 785,a sclerostin monoclonal antibody[J].Journal of Bone and Mineral Research the Official Journal of the American Society for Bone&Mineral Research, 2011,26(1):19-26.

Effect of combined treatment with parathyroid hormone and sclerostin antibody capsules in the treatment of osteoporosis in female SD rats

CHEN Xin,PAN Yuehao,JIN Guohua,et al.Department of Orthopaedics,Yiwu Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Yiwu 322000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the efficacy of parathyroid hormone(PTH)and sclerostin antibody (Scl-Ab)for treatment of osteoporosis in female SD rats. Methods Female SD rats underwent bilateral ovariectomy (OVX,n=65)or sham-operation(sham,n=5).Five overiectomized rats were randomly selected and bone mass density(BMD)of tibia was measured to approve the success of osteoporosis model.The remaining overiectomized rats were randomly divided into 4 groups with 15 in each group.PTH(60μg/kg,3/wk),Scl-Ab(25mg/kg,2/wk)and PTH(60μg/kg,3/wk)plus Scl-Ab(25mg/kg,2/wk)were injected subcutaneously for 12 wks to rats in PTH,Scl-Ab and PTH+Scl-Ab groups respectively,no drugs were given to rats in OVX group.The tibial metaphyseals of rats were harvested for evaluation.The results of treatment for osteoporosis were evaluated by micro-computerized tomography (micro-CT),histological examination and biomechanical measurement. Results Comparison with OVXgroup,the tibial metaphyseals from groups Scl-Ab,PTH and PTH+Scl-Ab showed a higher BMD, BV/TV,Tb Th,Tb N,Conn D,maximum load,stiffness and a lower Tb Sp,and the effects were strongest in PTH+Scl-Ab group. The effect of Scl-Ab or PTH alone was significantly lower than that of combined use in prevention and treatment of osteoporosis of ovariectomized rats. Conclusion The results indicate that Scl-Ab plus PTH had an additive effect on osteoporosis in overiectomized rat.

OVXrats Parathyroid hormone Osteoporosis Sclerostin antibody

2016-07-19）

（本文编辑：陈丹）

322000 温州医科大学附属义乌医院（义乌市中心医院）骨科

陈欣，E-mail：ywchenxin@163.com