茴鱼微卫星标记开发及保护遗传学研究进展

刘云国，刘凌霄，王咏星

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.临沂市农业科学院，山东 临沂 276012)

茴鱼微卫星标记开发及保护遗传学研究进展

刘云国1，刘凌霄2，王咏星1

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.临沂市农业科学院，山东 临沂 276012)

茴鱼；微卫星标记；遗传多样性；系统发育学

茴鱼 (Thymallus)隶属于鲑形目、鲑科、茴鱼亚科，是一类具有重要渔业价值的珍稀名贵冷水性鱼类[1-2]。目前已知该属鱼类主要有分布于欧洲的欧洲茴鱼(T.thymallus)、分布于北美洲的北极茴鱼(T.arcticus)和亚洲北部的其他茴鱼种和亚种。其中，亚洲东北部是茴鱼物种多样性最丰富的地区。在东西伯利亚地区的贝加尔湖、勒拿河、叶尼塞河及其他环北冰洋河流水系中分布有贝加尔茴鱼(T.baicalensis)、东西伯利亚茴鱼(T.pallasii)、勒拿河茴鱼(Thymallussp.)等。该属在黑龙江流域中国境内分布有3个种，分别为黑龙江茴鱼 (T.grubii)、下游黑龙江茴鱼(T.tugarinae)，以及后期发现的一个北极茴鱼亚种(T.arcticusssp.)[3-4]。另外，在整个黑龙江水系还分布有布列亚茴鱼(T.burejensis)及黄斑茴鱼(T.grubiiflavomaculatus)等。新发现的北极茴鱼亚种在黑龙江水系仅分布于上游区域的呼玛河、额木尔河等支流，地理分布范围狭小，种群数量较少[5]。新疆北极茴鱼(T.arcticusgrubei)属于北极茴鱼的一个亚种，野生资源主要分布在新疆额尔齐斯河的上游各支流如叶尔特斯河、库依尔特斯河、克兰河、喀依尔特斯河、喀拉额尔齐斯河等地[6-7]。由于茴鱼对生活环境要求比较苛刻，生存能力比较脆弱，种群资源容易受到外界环境变化和人类活动的影响。目前，正面临着第六次淡水鱼类的灭绝危机时代，世界范围内茴鱼分布区域逐渐缩小，种群资源已经严重衰退[8]。因此，笔者综述了茴鱼属鱼类在微卫星标记开发、遗传变异分析、遗传多样性评价及系统地理学等保护遗传学方面的研究进展，以期为该属鱼类的进一步研究提供指导，更好的保护其自然资源。

1 茴鱼微卫星标记开发研究

微卫星标记作为一种共显性遗传标记，可鉴别纯合子和杂合子；具有丰富的多态性和良好的重复性，比其他显性分子遗传标记如AFLP、RAPD、ISSR等具有更强的遗传检测能力。近十几年来，水产生物微卫星标记的开发一直是研究的热点，因为微卫星标记不仅能为遗传多样性研究、种群结构分析、个体识别、遗传图谱构建等奠定基础，同时也能对野生资源开发以及遗传育种工作提供可利用的遗传资料。当前，获取微卫星的方法主要有基因组富集文库法、近缘种杂交扩增法、基因组和cDNA数据库筛选法、基于RAPD、AFLP、ISSR等扩增序列的筛选法和基于第二代测序技术的全基因组筛选法等。Koskinen等[9]通过杂交扩增的方法，发现鲑鱼中部分微卫星标记在欧洲茴鱼和北极茴鱼能够通用。Snoj等[10-12]首先从欧洲茴鱼中直接开发了8个特异微卫星标记：BFRO004、BFRO014、BFRO015、BFRO016、BFRO017、BFRO018、BFRO010和BFRO011。Koskinen等[13]利用鲑科鱼类和欧洲茴鱼中的17个微卫星位点研究了微卫星引物在北极茴鱼中的杂交扩增情况，发现大部分位点在北美北极茴鱼中能产生扩增和多态性。Vasemaji等[14]通过大西洋鲑(Salmosalar)中75条EST微卫星标记的杂交扩增，发现部分位点在欧洲茴鱼等其他5种鱼类中扩增成功。Diggs等[15]从北美北极茴鱼中开发了12条微卫星标记，并在黑龙江茴鱼、布列亚茴鱼、欧洲茴鱼等几个种及亚种间显示了一定的扩增通用性。Junge等[16]通过构建微卫星富集DNA文库，从欧洲茴鱼中筛选到了19个微卫星位点，发现部分微卫星标记能够在北美北极茴鱼、北极红点鲑(Aphanomycesinvadans)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鲑中杂交扩增。表1列出了目前从茴鱼属鱼类直接开发的微卫星标记。

表1 从茴鱼属鱼类直接开发的微卫星标记

2 茴鱼遗传多样性及系统地理学研究

物种的遗传多样性是生命进化和物种分化的基础，为环境改变引起的适应性反应提供了必要的基因型。它可以赋予某一群体适应环境改变、环境压力和抵抗病菌、病毒的能力[17]。最大限度地维持种内遗传多样性水平，是保证其遗传潜力和持续利用种质资源的前提。基因变异越丰富，杂合度越高，对环境的适应能力就越强，在生长、繁殖力和抗逆性等经济性状上也更有优势。目前，微卫星标记和线粒体测序技术广泛应用到了茴鱼属鱼类的遗传变异、遗传多样性和群体遗传结构分析及保护遗传学研究中，其中，以欧洲茴鱼、北极茴鱼、黑龙江茴鱼和下游黑龙江茴鱼开展的研究工作较多，它们都为这些茴鱼遗传多样性评价和遗传资源的保护提供了重要的参考数据。

2.1 欧洲茴鱼

2.2 北极茴鱼

在北极茴鱼的研究上，Lynch等[39]率先利用形态学标记和蛋白质电泳等生化标记研究了北美北极茴鱼的遗传变异和遗传分化。随后，Redenbach等[40]从动物地理学的角度上研究了北美北极茴鱼线粒体DNA的变异情况。Stamford等[41]利用mtDNA-RFLPs和微卫星标记分析了北美北极茴鱼系谱发育地理学，包括它的分化、起源及同欧亚茴鱼的亲缘关系。随后，Stamford等[42]又利用7个微卫星标记研究了加拿大不列颠哥伦比亚省安宁河流域一带11个北极茴鱼个体的微卫星位点变异情况，目的是分析北极茴鱼群体的亚结构河评价水电站的建立对群体大小的影响。Weiss等[43]通过测定12个表型特征数据和线粒体控制区DNA测序研究了勒拿河及周边北极水系北极茴鱼两个主要地理谱系的表型和遗传差异。Yasuike等[44]通过测定北极茴鱼和欧洲茴鱼的线粒体DNA序列，从整个线粒体基因组水平上研究了它们同其他鲑科鱼类的系统进化关系。我国学者马波等[3]首先在黑龙江流域鉴定了一个北极茴鱼亚种。随后，孙家贤等[45]利用微卫星标记对包括黑龙江北极茴鱼亚种在内的3种茴鱼的遗传多样性进行了比较研究，探讨了其种群遗传结构、分化水平及分类学地位，为制定保护管理策略提供了遗传学理论依据。马波等[5]利用线粒体D-loop基因序列分析了黑龙江上游北极茴鱼亚种的群体遗传结构，结果表明遗传多样性较低，单倍型多样性指数和核苷酸多样性远低于同域分布的其他种茴鱼。Reilly[46]从加拿大艾伯达地区的干草河、和平河、阿萨巴斯卡河的40个地点捕获北极茴鱼1116尾，利用微卫星标记进行了群体遗传学和景观遗传学研究，发现遗传多样性由南至北逐渐衰退，其中养殖群体的遗传多样性最低。

2.3 黑龙江茴鱼和下游黑龙江茴鱼

针对黑龙江茴鱼和下游黑龙江茴鱼，利用微卫星标记和线粒体测序技术，也开展了较多研究工作。Froufe等[47]早前开展了东西伯利亚地区黑龙江茴鱼的形态和遗传变异研究。Knizhin等[48]利用形态学标记和线粒体控制区测序研究了俄罗斯境内黑龙江茴鱼的形态学和遗传学多样性。除此之外，我国学者马波等[49]在该方面做了大量研究工作，在中国境内黑龙江水系的鸟苏里江、呼玛河、额木尔河等河流采集到茴鱼属鱼类标本，经鉴定为中国一新纪录种即下游黑龙江茴鱼。马波等[1]根据线粒体DNA基因序列变异分析显示鸭绿江茴鱼为黑龙江茴鱼同物异名，由于茴鱼属内各种、亚种之间的区分及命名比较混乱，该项研究进一步规范了茴鱼属鱼类的定名。马波等[50]利用微卫星标记对乌苏里江、黑龙江上游的呼玛河和额木尔河3个下游黑龙江茴鱼地理种群的遗传多样性进行了比较研究。孙家贤等[45]利用微卫星标记对采自黑龙江上游呼玛河同域分布的黑龙江茴鱼、下游黑龙汀茴鱼及北极茴鱼亚种3种茴鱼进行了种群遗传结构研究，并比较其遗传多样性。马波等[3]基于茴鱼属鱼类的线粒体D-loop片段全序列变异，对分布于黑龙江上游中国境内的呼玛河、额木尔河等水系中形态特征差异显著且同域分布的3种茴鱼进行了分子系统发育关系研究，综合3种茴鱼在黑龙江水系的地理分布现状，对其起源及演化进行了初步推测。Ma等[51]通过测定线粒体控制区DNA序列分析了黑龙江流域黑龙江茴鱼的系统地理学和群体遗传结构。Semenchenko等[52]利用线粒体cyt b基因测序数据比较分析了远东地区下游黑龙江茴鱼及黄斑茴鱼的遗传分歧。目前，Zhao等[53-54]已完成了黑龙江茴鱼线粒体DNA的测序工作，全长约16.7 kb，包含13个蛋白质基因，22个tRNA基因和2个核糖体基因，为茴鱼遗传多样性和系统发育分析提供了更多DNA序列选择。

3 茴鱼遗传学研究存在的问题及解决途径

目前茴鱼中开发的微卫星标记相对较少，已经开发的微卫星位点主要集中在欧洲茴鱼和北美北极茴鱼，其他一些茴鱼种和亚种尚未见有微卫星标记开发的报道。而且很多位点是通过相近物种杂交扩增获得，应用到茴鱼上时不可避免的会出现多态性及扩增稳定性的降低。这些微卫星标记还远不能满足茴鱼遗传图谱构建、微地理群体的遗传结构评价及优良性状QTL精细定位等进一步遗传学研究的要求。Koskinen等[55]通过欧洲茴鱼的试验证明了将更多的微卫星位点应用到群体遗传学上的优势，如果微卫星位点较少的话，会导致群体进化关系分析错误的发生。因而，开发更多的微卫星标记，特别是针对欧洲茴鱼和北美北极茴鱼以外其他茴鱼种和亚种开发特异微卫星标记很有必要。

近年来，遗传连锁图谱的构建是水产遗传学研究的热点领域，很多水产动物的遗传连锁图谱已经建立。遗传连锁图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。它是实现数量性状基因定位、分子标记辅助选育和遗传改良的基础。开展遗传连锁图谱构建工作对于茴鱼遗传多样性保护和资源开发都具有重要的意义。然而，由于茴鱼遗传背景基础研究工作比较薄弱，遗传连锁图谱构建工作困难重重，主要原因在于茴鱼作为水产动物不像农作物那样可以方便地建立并维持较大的作图群体。解决的途径就是利用双假测交法和单配子PCR分型技术进行遗传连锁图谱构建。基于F1群体作图的拟测交理论，仅需两代系谱的材料可以在较短的时间内建立做图群体。同时，可以避免显性标记无法区分显性纯合个体和杂合个体的问题。单配子PCR分型技术是构建连锁图谱的有效方法，在遗传图谱构建中显示了广阔的应用前景。该方法解决了家系分析法世代间隔长，后代数目少，多态信息含量低的缺点。由于微卫星是共显性遗传，对亲本的扩增结果易于找到杂合位点，可应用杂合微卫星标记构建遗传连锁图谱。单配子PCR分型技术应用于茴鱼具有独到的优点，因为茴鱼的家系分析较为困难，但茴鱼的单配子易获得，单个卵子分型技术尤其适合于茴鱼的遗传图谱构建。

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A Review:Research Progress of Development of Microsatellite Markers and Conservation Genetics in Grayling

LIU Yunguo1, LIU Lingxiao2, WANG Yongxing1

(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urümqi 830046, China;2.Linyi Academy of Agricultural Sciences, Linyi 276012, China

grayling; microsatellite marker; genetic diversity; phylogenetics

S917

C

1003-1111(2016)01-0087-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.016

2015-04-10；

2015-07-29.

新疆自治区自然科学基金资助项目(2015211C261).

刘云国(1977-)，男，博士，教授级高级工程师；研究方向：水产生物技术. E-mail: yguoliu@163.com.