嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力的影响

刘 迪，董晓慧，谭北平，杨奇慧，迟淑艳，刘泓宇，章 双

( 广东海洋大学 水产学院 水产动物营养与饲料试验室，广东 湛江 524088 )

嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力的影响

刘 迪，董晓慧，谭北平，杨奇慧，迟淑艳，刘泓宇，章 双

( 广东海洋大学 水产学院 水产动物营养与饲料试验室，广东 湛江 524088 )

水温(29±3) ℃下，给体质量约0.5 g的凡纳滨对虾投喂在基础饲料中分别添加0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、1.00%的嗜酸乳杆菌的7种饲料8周。试验结果表明，嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾的存活率无显著影响(P>0.05)，而添加嗜酸乳杆菌组的凡纳滨对虾体质量增加率均高于对照组，0.10%组的质量增加率显著高于对照组，饲料系数明显低于对照组(P<0.05)。0.05%、0.10%、0.20%、0.30%组凡纳滨对虾的血清超氧化物歧化酶活力高于对照组，0.10%组显著高于对照组(P<0.05)。各试验组之间过氧化氢酶活力差异显著(P<0.05)，当嗜酸乳杆菌添加量为0.20%时活力最高。除1.00%添加组外，其他组酚氧化酶活力均高于对照组，当添加量为0.05%时活力明显高于对照组(P<0.05)。攻毒试验结果表明，各处理96 h对虾存活率无显著差异(P>0.05)，但嗜酸乳杆菌添加组对虾存活率皆高于对照组，表明添加嗜酸乳杆菌在一定程度上可以提高凡纳滨对虾的抗病力。

嗜酸乳杆菌；凡纳滨对虾；生长；免疫力；抗病力

凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei)是我国重要的养殖虾类，近年来养殖业发展快速，病害频发。人们大量使用抗生素来预防和治疗虾病，这不仅造成污染，甚至会危害人类健康。为确保对虾产业的健康发展，寻找合适的环保抗生素替代品成了目前的研究热点[1]。

嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)是革兰氏阳性益生菌[2]，可调节机体肠道菌群平衡[3]，促进肠胃消化，释放乳酸等次级代谢产物，抑制肠道致病菌[4]，提高机体的抗病力。虽然有关嗜酸乳杆菌的研究颇多，但不同含量的嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力影响的研究却很少。本研究在对虾饲料中加入不同水平的嗜酸乳杆菌，探究其对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验虾苗购于湛江粤海水产种苗有限公司，试验嗜酸乳杆菌(优贝宝)由大庆仕合源乳业有限公司提供，攻毒所用哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)菌种由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点试验室提供。

试验饲料以鱼粉、豆粕为主要蛋白源，以鱼油、大豆油、卵磷脂为脂肪源，基础饲料配方见表1。在基础饲料中分别添加0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、1.00%的嗜酸乳杆菌，配制成7种饲料。饲料原料粉碎后过80目筛网(0.18 mm)，各常用原料按饲料配方准确称量质量，在V型立式混合机混合10 min，微量添加成分以面粉为载体逐级扩大混匀，然后加入V型立式混合机与原料再充分混匀10 min，再加入预先混合好的鱼油、大豆油和大豆磷脂油。将油脂微小颗粒搓散直至可顺利通过60目筛网(0.25 mm)，将搓好的原料放入搅拌机中，在搅拌过程中加入氯化胆碱和适量的水，搅拌均匀后用双螺杆挤条机加工成1 mm和1.5 mm两种规格的饲料，60 ℃熟化30 min，风干后用封口袋分装，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

投喂试验在湛江东海岛广东海洋大学海洋生物研究基地进行。试验前虾苗在室外水泥池暂养30 d，待体质量约0.5 g时，挑选规格一致、体格健壮的虾苗分为7个处理组，每个处理3个重复，每个重复一个0.3 m3的玻璃钢桶，每桶放40尾虾，养殖8周。 试验开始后2周内若有虾死亡，及时将其捞出称质量，并补回同样体质量的虾；2周后若有试验虾死亡，捞出称量质量，记录。试验期间日投喂4次(7:00、11:00、17:00和21:00)，投喂量为虾体质量的8%～10%，并根据摄食、天气等适当调整。投喂1 h后观察对虾摄食情况，试验初期每两天换水2/3，养殖结束前10 d每天换水1/2。试验期间盐度27±2，水温(29±3) ℃，溶解氧>7.0 mg/L，氨氮含量<0.03 mg/L。

表1 试验饲料的组成与营养水平(干物质基础) %

a:每千克维生素预混料含有:VA 10 g,VD350 g,VE 99 g,VK 5.0 g,VB125.50 g,VB225 g,VB650 g,VB120.1 g,泛酸钙 61 g,烟酸101 g,生物素25 g,肌醇 153.06 g,叶酸6.25 g,纤维素389.09 g.

b:每千克矿物质预混料含有:KIO40.03 g,CoCl2·6H2O 4.07 g,CuSO4·5H2O 19.84 g,柠檬酸铁 13.71 g,ZnSO4·7H2O 28.28 g,MgSO4·7H2O 0.12 g,CaH2PO480 g,MnSO4·H2O 12.43 g,KCl 15.33 g,Na2SeO32 g,沸石粉824.19 g.

1.3 样品采集与测定

试验结束时停喂24 h后，每桶对虾称量质量并记录尾数。每桶随机取5尾虾，于-20 ℃冰箱中保存，用于分析体成分。另从每桶中随机抽取15尾虾，用 1 mL 无菌注射器自第五步足基部血窦抽血。将血液注入1.5 mL的离心管后，迅速置于盛有碎冰的冰盒中，采样结束后于冰箱4 ℃放置过夜，次日8000 r/min 离心10 min，上清液-80 ℃下保存，用于测定酶活力。从每个处理组随机取10尾虾，用密度为1.27×106cfu/mL的哈维氏弧菌进行攻毒试验。通过专用注射器于对虾第二腹节背部注射，注射后观察对虾96 h的存活状况。

按下式计算：

存活率/%=(n2/n1)×100%

质量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

饲料系数=m3/(m2-m1)

蛋白质效率/%=(m2-m1)/(m3×P)×100%

特定生长率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，n2为试验终末对虾数量(尾)，n1为试验初始对虾数量(尾)；m1、m2分别为初始和终末对虾平均体质量(g)；t为试验时间(d)；m3为摄入的饲料干质量(g)；P为饲料蛋白质含量(%)。

试验饲料以及全虾中水分、粗脂肪、粗蛋白、粗灰分含量按照国标GB 5009.3-2010、GB/T 6433-2006、GB/T 6432-1994、GB/T 6438-2007进行测定。

对虾血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定。酚氧化酶、溶菌酶活性送血清样品至南京建成生物工程研究所检测。

1.4 数据处理

数据用平均值±标准差表示，用 SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和Duncan多重比较法，当P<0.05 时差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾生长性能的影响

饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾生长性能的影响见表2。表2显示，嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾的存活率无明显影响(P>0.05)。0.10%嗜酸乳杆菌组的对虾质量增加率和特定生长率显著高于对照组(P<0.05)，其他5组的质量增加率和特定生长率略高于对照组，但与对照组无显著差异(P>0.05)。嗜酸乳杆菌的添加量为0.10%组的对虾的饲料系数明显低于对照组(P<0.05)，而0.40%和1.00%组饲料系数明显高于对照组(P<0.05)；0.05%、0.30%处理组对虾的蛋白质效率与对照组无明显差异(P>0.05)，0.10%处理组蛋白质效率明显高于对照组(P<0.05)，0.20%、0.40%、1.00%处理组蛋白质效率明显低于对照组(P<0.05)。

2.2 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾体成分的影响

饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾体成分的影响结果见表3。表3显示，各处理组对虾的水分、粗蛋白、粗脂肪含量无明显差异(P>0.05)；嗜酸乳杆菌添加量为0.40%处理组粗灰分含量明显高于对照组(P<0.05)，其他组与对照组无明显差异(P>0.05)。

2.3 饲料中嗜酸乳杆菌水平的对凡纳滨虾血清中相关酶活力的影响

饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾血清中相关酶活力的影响结果见表4。表4显示， 超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性随饲料中嗜酸乳杆菌添加量的增加而先升后降，嗜酸乳杆菌添加量为0.05%～0.30%的试验组过氧化氢酶活力显著高于对照组(P<0.05)，在添加量为0.20%时，达到最高。嗜酸乳杆菌添加量为0.10%时，超氧化物歧化酶活力显著高于对照组(P<0.05)，其余各组间无显著差异(P> 0.05)；酸性磷酸酶随着嗜酸乳杆菌添加量的升高而逐渐升高，0.40%和1.00%组酸性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)；0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%处理组碱性磷酸酶活力显著高于对照组(P<0.05)，1.00%处理组与对照组无明显差异；0.05%、0.30%、0.40%处理组酚氧化酶活性明显高于对照组(P<0.05)，其余组间无显著差异；除1.00%处理组溶菌酶活性与对照组相比无显著差异(P>0.05)外，其余各处理组溶菌酶活力均显著高于对照组(P<0.05)。

2.4 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾抗病力的影响。

饲料中嗜乳酸杆菌水平对凡纳滨对虾抗病力的影响结果见表5。表5显示，各处理组凡纳滨对虾的存活率无明显差异(P>0.05)，但嗜乳酸杆菌添加量为0.30%时存活率最高。

表2 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾生长性能的影响

注:同一行中上标不同字母的平均值表示组间有显著性差异(P<0.05).下同.

表3 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾体成分的影响 %

表4 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾血清酶活力的影响

表5 饲料中嗜酸乳杆菌水平对凡纳滨对虾抗病力的影响 %

3 讨 论

3.1 嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾生长性能的影响

嗜酸乳杆菌是动物饲料中重要的微生态添加剂，具备良好的耐受性，能够在动物肠道中定殖，改善肠道酸性环境，促进营养物质吸收，降低氨等毒性物质的积累、平衡肠道菌群、促进动物生长和提高免疫力、抗病力等[5-7]。 饲喂含乳酸杆菌的饲料28 d，可显著提高肉仔鸡的质量增加率[8]。张常明等[9]在饲料中适当添加乳酸菌，显著提高了断奶仔猪的生产性能。建鲤(Cyprinuscarpiovar)幼鱼的质量增加率和摄食量随饲料中乳酸杆菌水平的增加而显著提高[10]。Suzer等[11]发现，黑鲷(Sparusmacrocephlus)幼鱼摄食含有乳酸菌的饲料，存活率和质量增加率显著提高。本试验结果表明，添加嗜酸乳杆菌可提高凡纳滨对虾的质量增加率、特定生长率，降低饲料系数，其中添加量为0.10%时效果最好，这与王国霞等[12]的试验结果类似。

3.2 嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾免疫力的影响

超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、酚氧化酶和溶菌酶是反应动物机体免疫力和抗病力的重要指标。动物机体内氧自由基过多就会攻击正常的组织结构如细胞膜等，使其产生氧化损伤，严重时还会导致机体细胞死亡。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶则主要清除体内所产生的氧自由基并抑制其生成。它们可以提高机体抗氧化能力，是评价机体对外界应激反应的指标之一[13-15]。李瑞等[16]灌喂新生仔猪德氏乳杆菌(L.delbrueckii)菌液一段时间后，仔猪血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性增强，总抗氧化能力显著高于对照组。王全溪等[17]在肉鸡饲料中添加100 mg/kg乳酸菌时，血清中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力显著提高。Lee等[18]发现，在饲料中添加乳酸菌PL11可显著提高日本鳗鲡(Anguillajaponica)超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力。本试验中，凡纳滨对虾血清超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力随饲料中嗜酸乳杆菌含量的增加而先升后降，其原因可能是嗜酸乳杆菌或其代谢产物刺激了凡纳滨对虾体内的非特异性免疫机制[19]，提升了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力，但当嗜酸乳杆菌的含量增加时会产生过多的有机酸、双乙酸、过氧化氢等代谢产物抑制了这两种酶的活力。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是一类可将对应底物水解去磷酸化的酶类，可以促进甲壳动物骨骼和几丁质外壳的形成[20]，也是重要的免疫防御体系，具有解毒功能[21]。本试验中，凡纳滨对虾体内的酸性磷酸酶活性随着嗜酸乳杆菌添加量的升高而逐渐升高，均高于对照组，碱性磷酸酶则呈现先升后降的趋势。酚氧化酶是酚氧化酶原激活系统的关键物质，其主要功能是免疫作用和修复机体伤口。酚氧化酶经过一系列反应产生黑色素抵御外来细菌、病毒的入侵[22]，直接体现甲壳类动物的免疫力和抗病力[23-24]。溶菌酶通过吞噬细胞来杀灭细菌而消除体内异物，发挥防御功能[25-26]。Son等[27]等报道，斜带石斑鱼(Epinephelusspcoioides)摄食加入植物性乳酸菌的饲料时，血清中溶菌酶活性显著提高。Giri等[28]在饲料中加入乳酸杆菌VSG3，饲喂60 d后发现，南亚野鲮(Labeorohita)的血清中溶菌酶活力显著高于对照组。本试验中，凡纳滨对虾体内的酚氧化酶和溶菌酶活力均有所提高，部分处理组显著高于对照组，但达到最高酶活的嗜酸乳杆菌添加剂量不尽相同，说明适量添加嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾的体液免疫也起到了积极作用。

3.3 嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾抗病力的影响

曾地刚等[29]通过链球菌(Streptococcus)攻毒试验发现，摄食含有乳酸菌饲料的罗非鱼(Oreochromisspp)存活率显著提高。Rengpipat等[30]发现，在用含有乳酸菌的饲料饲喂尖吻鲈(Latescalcarifer)一段时间后，对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的抵抗力提高。本试验中，通过哈维氏弧菌攻毒试验96 h后，虽然发现各组之间存活率无明显差异，但添加嗜酸乳杆菌的试验组存活率皆比对照组高，其原因可能是嗜酸乳杆菌刺激肠黏膜免疫表达，提高了血清中抗超氧阴离子自由基的含量，使凡纳滨对虾的抗染病能力增强[31]。其中0.30%添加组存活率最高，与0.30%添加组的酚氧化酶和溶菌酶的活力相对较高相吻合。

[1]Gatesoupe F J.The use of probiotics in aquaculture [J].Aquaculture,1999,180(1/2):147-165.

[2]郭兴华.益生菌基础及应用[M].北京:北京科学技术出版社,2002:45-65.

[3]张帆,王建华,刘立恒,等.嗜酸乳杆菌的培养条件及其生物学特性[J].食品与发酵工业,2005，31(3):43-46.

[4]余萍.嗜酸乳杆菌生理特性及其冻干工艺的研究 [D].哈尔滨:东北林业大学,2008.

[5]程光胜.山羊传染性胸膜肺炎病原分离及诊断方法研究[D].重庆:西南大学,2006.

[6]Gibson G R,Roberfroid M B.Dietary modulation of the human colonic microbiota:introducing the concept of prebiotics[J].Journal of Nutrition,1995,125(6):1401-1412.

[7]胡毅,谭北平,麦康森,等.饲料中益生菌对凡纳滨对虾生长、肠道菌群及部分免疫指标的影响[J].中国水产科学,2008,15(2):244-251.

[8]徐基利.不同乳酸菌及其添加量对肉仔鸡生长性能、盲肠菌群和免疫功能的影响[D].哈尔滨:东北农业大学,2011.

[9]张常明,李路胜,王修启,等.乳酸菌对断奶仔猪生产性能及免疫力的影响[J].华南农业大学学报,2006,27(3):81-84.

[10]刘羽.饲粮中添加乳酸杆菌对幼建鲤生长性能、消化吸收功能和免疫功能的影响[D].雅安:四川农业大学,2011.

[11]Suzer C,Coban D,Kamaci H O,et al.Lactobacillusspp.bacteria as probiotics in gilthead sea bream (SparusaurataL.) larvae:effects on growth performance and digestive enzyme activities [J].Aquaculture,2008,280(1/4):140-145.

[12]王国霞,黄燕华,周晔,等.乳酸菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能、消化酶活性和非特异性免疫的影响[J].动物营养学报,2010,22(1):228-234.

[13]Rengpipat S,Rukpratanporn S,Piyatiratitivorakul S,et al.Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeusmonodon) by a probiont bacterium (BacillusS11)[J].Aquaculture,2000,191(4):271-288.

[14]Yang X J,Chen J,Zhang C X,et al.Evaluation of antioxidant activity of fermented soybean meal extract[J].African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2012,6(24):1774-1781.

[15]王永胜,钱鲁闽,陈昌生,等.抗生素和有益微生物对凡纳滨对虾非特异性免疫效应的研究[J].台湾海峡,2008,27(5):161-167.

[16]李瑞,侯改凤,黄其永,等.德氏乳杆菌对哺乳仔猪生长性能、血清生化指标、免疫和抗氧化功能的影响[J].动物营养学报,2013,25(12):2943-2950.

[17]王全溪,林滉,贾洪强,等.乳酸菌素对肉鸡血清生化指标和抗氧化功能的影响[J].动物营养学报,2012,24 (1):131-136.

[18]Lee J S,Cheng H,Damte D,et al.Effects of dietary supplementation ofLactobacilluspentosusPL11 on the growth performance,immune and antioxidant systems of Japanese eelAnguillajaponicachallenged withEdwardsiellatarda[J].Fish & Shellfish Immunology,2013,34(3):756-761.

[19]邝哲师,赵祥杰,叶明强,等.乳酸菌对水产养殖动物抗氧化应激与免疫力影响研究进展[J].畜牧与饲料科学,2011,32(8):39-41.

[20]唐林,林珠,李永明,等.不同大小机械牵张力对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶的影响[J].解放军医学杂志,2006,31(6):580-581.

[21]何海琪,孙凤.中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究[J].海洋与湖沼,1992,23(5):555-560.

[22]汪小锋.中国对虾(Penaeuschinensis)酚氧化酶的生物化学性质及几种免疫促进剂对中国对虾酚氧化酶和血细胞的影响 [D].青岛:中国海洋大学,2002.

[23]樊廷俊,汪小锋.中国对虾(Penaeuschinensis)酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质[J].化学与生物物理学报,2002,31(5):589-591.

[24]Sung H H,Chang H J,Her C H,et al.Phenoloxidase activity of hemocytes derived fromPenaeusmonodonandMacrobrachiumrosenbergii[J].Journal of Invertebrate Pathology,1998,71(1):26-33.

[25]刘小玲,曹俊明,邝哲师,等.嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼生长、非特异性免疫酶活性和肠道菌群的影响[J].广东农业科学,2013(1):123-126.

[26]杨奇慧,谭北平,董晓慧,等.铬对凡纳滨对虾生长性能、血清生化指标及非特异性免疫酶活性的影响[J].动物营养学报,2013,25(4):795-804.

[27]Son V M,Chang C C,Wu M C,et al.Dietary administration of the probiotic,Lactobacillusplantarum,enhanced the growth,innate immune responses,and disease resistance of the grouperEpinepheluscoioides[J].Fish & Shellfish Immunology,2009,26(5):691-698.

[28]Giri,S S,Sukumaran,V,Oviya M,et al.Potential probioticLactobacillusplantarumVSG3 improves the growth,immunity,and disease resistance of tropical freshwater fish,Labeorohita[J].Fish & Shellfish Immunology,2013,34(2):660-666.

[29]曾地刚,雷爱莹.乳酸杆菌对罗非鱼生长和抗病力的影响[J].南方农业学报,2011(3):328-331.

[30] Rengpipat S,Rueangruklikhit T,Piyatirativoralul S.Evaluations of lactic bacteria as probiotics for juvenile seabassLatescalcarifer[J].Aquaculture Research,2008,39(2):134-143.

[31]黄燕华,周晓波,王国霞,等.5种乳酸菌对奥尼罗非鱼免疫和抗病力的影响[J].水产科学,2014,33(10):601-605.

EffectsofLactobacillusacidophilusonGrowthPerformance,ImmunityandDiseaseResistanceinPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

LIU Di,DONG Xiaohui,TAN Beiping,YANG Qihui,CHI Shuyan,LIU Hongyu,ZHANG Shuang

( Laboratory of Aquatic Animal Nutrition and Feed,Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China )

Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannameiwith body weight of 0.5 g were fed the experimental diets containing 0%,0.05%,0.10%,0.20%,0.30%,0.40% and 1.00% of bacteriumLactobacillusacidophilusat water of (29±3) ℃ for 8 weeks.The results showed that survival rate was not significantly affected by the probiotics (P>0.05).There were higher weight gain in the shrimp fed the diets containingL.acidophilusthan that in the control group,significantly higher in the 0.10% group than that in the control group (P<0.05),with significantly lower food conversion ratio than that in the control group(P<0.05).The shrimp fed the diets containing 0.05%,0.10%,0.20%,and 0.30% of the probiotics had higher activity of superoxide dismutase (SOD) than that in the control group,especially significantly higher in the 0.10% group than that in the control group (P<0.05).The catalase(CAT) activity was found to be significantly different among all groups(P<0.05),the maximal value in 0.20% group.Except for 1% group,the activity of phenoloxidase (PO) was higher in the other groups than that in the control group,significantly higher in 0.05% group than that in the control group (P<0.05).No differences in survival rate were observed in the shrimp injected withVibrioharveyiin 96 h,even though higher in the shrimp fed the diets containingL.acidophilusthan that in the control group,indicating that dietryL.acidophiluscould increase the disease resistance in Pacific white leg shrimp.

Lactobacillusacidophilus;Litopenaeusvannamei; growth; immunity; disease resistance

S968.22

A

1003-1111(2016)01-0037-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.007

2015-09-23；

2015-10-31.

国家公益性行业(农业)科研专项(201003020).

刘迪(1991-)，男，硕士研究生；研究方向：水产经济动物营养与饲料.E-mail：liudi_gdou@163.com.通讯作者：董晓慧(1970-)，女，教授；研究方向：水产经济动物营养与饲料.E-mail：dongxiaohui2003@163.com.