仿刺参中国群体与韩国群体杂交子代微卫星标记分析

王 鹤，王田田，胡丽萍，赵 强，孙国华，孙灵毅

( 1.烟台市水产研究所，山东 烟台 264003； 2.山东省海洋资源与环境研究院，山东 烟台 264006 )

仿刺参中国群体与韩国群体杂交子代微卫星标记分析

王 鹤1，王田田1，胡丽萍1，赵 强1，孙国华2，孙灵毅1

( 1.烟台市水产研究所，山东 烟台 264003； 2.山东省海洋资源与环境研究院，山东 烟台 264006 )

应用微卫星DNA技术对仿刺参中国群体、韩国群体及其杂交后代的遗传多样性进行了研究。15对微卫星引物共扩增获得60个等位基因，平均等位基因数为4，平均有效等位基因数为2.5855。3个群体的平均观测杂合度分别为0.2965、0.3548、0.2755，平均期望杂合度为0.5296、0.5574、0.5364，多态性信息含量为0.0000～0.8480，平均值为0.4653、0.4860和0.4630。Hardy-Weinberg平衡的P值检验，发现3个群体普遍存在偏离平衡的现象。试验结果表明，15个位点中，14个位点为中度或高度多态，3个群体多样性处于中等偏上水平；韩国群体的遗传多样性水平在3个群体中最高，杂交后代并未表现出明显的杂种优势，但在某些微卫星位点观测到的等位基因频率和基因型频率表现出与亲本的差异，说明杂交过程使后代获得了一定程度的遗传分化，中国群体与韩国群体的杂交后代具一定的选育潜力。

仿刺参；遗传多样性；杂交；微卫星

仿刺参(Apotichopusjaponicus)自然分布于我国、韩国、日本及俄罗斯远东地区的部分海域，具有较高的营养保健和药用价值，是我国重要的海洋经济动物之一[1-2]。但近年来由于北方地区夏季高温导致海参大量死亡，造成了严重的经济损失，制约了整个行业的健康发展。以2013年为例，山东地区受夏季高温影响，池塘养殖、底播增殖海参大量死亡，产量骤减，经济损失严重，据不完全统计，仅烟台市受灾面积约达4.33×103hm2，直接经济损失约11亿元。如何让海参健康度夏，成为近年来北方地区制约海参养殖业发展的瓶颈问题。

杂交是水产动物育种的有效途径之一，不仅能够丰富遗传结构，使不同类型的亲本优良性状得以结合，还能获得具有杂种优势的新品种，故其在水产动物品种改良、预防种质退化等方面发挥了巨大作用[3]。优良性状的杂交优势在鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鲫鱼(Carassiusauratus)、罗非鱼(Oreochromis)等鱼类[4-6]；中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunstrituberculatus)等甲壳类[7-9]；海湾扇贝(Argopectensirradias)、皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等贝类[10-13]中均有较为广泛的应用。胡美燕等[14]报道了仿刺参日本群体(原文章中的日本红刺参)与中国群体正交、反交及自交后代在幼虫期和稚参期的生长性状，指出中国群体♂与日本群体♀杂交组合更具生长优势，杂种优势率较为明显。孙秀俊等[15]在此基础上通过对上述杂交优势组合杂交子代胚胎发育的观察，对比幼参培育期间杂交稚参与自交稚参的生长与成活情况，得出在高温条件下杂交苗种较自交苗种具明显生长优势的结论。

微卫星标记具有多态性高、共显性、遵循孟德尔遗传规律等特点，是当前水产动物遗传多样性研究中应用最多的分子标记[16-19]，在海参的遗传多样性研究中有较为广泛的应用[20-24]。潘传燕等[20]用FISCO方法构建了仿刺参的微卫星序列文库，筛选出118条微卫星DNA序列，并应用其中的20对序列分析了中国、韩国、俄罗斯、日本和美国的几种仿刺参的遗传多样性。谭杰等[22]在用微卫星技术分析烟台、威海、大连3个地理种群遗传多样性时，发现3个群体间的遗传变异较小，且大连群体和威海群体的亲缘关系更近。李雪燕等[23]将微卫星标记技术应用于仿刺参亲本识别中，并成功将229只仿刺参幼体在14只疑似亲本中找到真正亲本，鉴定成功率达95%以上。

仿刺参有多个不同地理种群，本研究中的韩国种群生活水温偏高，体色鲜艳呈暗红色，俗称韩国红刺参，且其夏眠时间短，生长速度快，具一定的耐高温特性。本研究以仿刺参韩国种群和中国种群作为亲本，开展杂交试验，以期通过杂交手段，使杂交后代获得亲本的耐高温特性，在同等高温条件下，降低死亡率，进而健康度夏，促进海参养殖业健康有序发展。本文利用微卫星标记技术对三者的DNA进行研究，分析其遗传多样性，旨在为培育耐高温杂交优势种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用仿刺参中国群体于2011年5月取自烟台海益苗业有限公司，韩国群体于2011年1月采自韩国济州岛沿海。采用同步催产方法，对中国群体和韩国群体亲本阴干、流水刺激后人工授精获得杂交子代。以中国群体、韩国群体和杂交子代作为3个群体，每个群体随机选取26只个体用于微卫星试验(由于引进的韩国群体数量有限，仅剩余26只，其他2个群体参照该数量随机选取26个个体)。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

将用于试验的仿刺参样品保存于无水乙醇中备用。用Segama试剂盒提取DNA，用分光光度计检测浓度后，于-20 ℃保存备用。

1.2.2 微卫星DNA标记的选择

本研究所用微卫星DNA标记引物参考文献[25]，选择其中25对引物合成备用。微卫星引物由上海生物工程技术服务有限公司合成, 引物具体信息见表1。

表1 微卫星引物的重复单元、引物序列和复性温度

1.2.3 多态性检测

以3个仿刺参群体基因组DNA 为模板摸索各引物退火温度后，进行PCR扩增。PCR扩增采用25 μL体系，其中包含 0.4 μmol/L的引物, 2.5 mol MgCl2, 0.2 mol dNTP, 1 U Taq DNA 聚合酶及约100 ng的基因组DNA。PCR 扩增条件参考文献[25]。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，选择有明显扩增产物的引物用8%(m/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。使用TaKaRa 公司10 bp DNA ladder Marker 为标准，人工计数统计条带。

1.2.4 数据统计

用Popgen32 软件计算各位点在3个群体中的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、群体间的相似性系数和群体间遗传距离。参照Botstein等[26]的方法计算各位点多态信息含量，χ2检验估计群体Hardy-Weinberg平衡偏离。根据群体间的Nei’s 遗传距离，用Mega5.0软件非加权组平均法构建群体间聚类图。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果及各位点遗传多样性

应用25对引物对中国群体、韩国群体、杂交后代3个群体各26只个体进行了PCR扩增，其中15对引物有明显的PCR产物，且15对引物均表现为多态。共获得60个等位基因信息点，每个位点获得的等位基因数从3(SSR8、SSR10、SSR15、SSR16、SSR18、SSR19、SSR20、SSR21)至9(SSR2)不等，每个位点的平均等位基因数为4。有效等位基因数在1.0000(SSR19)到7.3333(SSR2)之间，平均有效等位基因数为2.5855。3个群体的观测杂合度为0.0000～0.07500，平均观测杂合度分别为：0.2965(中国群体)、0.3548(韩国群体)、0.2755(杂交后代)，期望杂合度为0.0000～0.8837，平均期望杂合度分别为：0.5296(中国群体)、0.5574(韩国群体)、0.5364(杂交后代)。韩国群体的平均观测杂合度与平均期望杂合度均为3个群体最高。3个群体的多态性信息含量为0.0000(SSR19)～0.8480(SSR2)，韩国群体的多态性信息含量也为最高(0.4860)，其余两个群体平均多态性信息含量值为0.4653和0.4630。除SSR19为低多态性位点(多态性信息含量<0.25)外，SSR8、SSR10、SSR13、SSR15、SSR17、SSR18、SSR20和SSR21这8个位点表现为中度多态(0.25<多态性信息含量<0.5)，其余6个位点为高度多态(多态性信息含量>0.25)。通过P值检验，发现偏离Hardy-Weinberg平衡的现象在3个群体普遍存在，在本试验的15对引物中，仅有1对引物(SSR20)在3个群体中均符合平衡。中国群体在SSR19位点上表现为单态，韩国群体在该位点有2个条带，杂交参群体则明显有二者的杂交组合带(3条条带信息)(表2)。

2.2 遗传距离、相似性指数及非加权组平均法构建聚类图

根据15个微卫星位点在3个群体中的条带信息，计算遗传距离、相似性指数(表3)。中国群体与杂交子代的遗传距离最远，距离为0.1880，中国种群与韩国群体、韩国群体与杂交子代的遗传距离相近，分别为0.0990和0.0972，遗传相似性数据结果与此吻合。利用Nei’s遗传距离数值用非加权组平均法对3个群体进行聚类分析亲缘关系，结果表明：杂交后代与韩国群体亲缘关系更近，表现为先与韩国群体聚为一支，再与中国群体聚合(图1)。

3 讨 论

3.1 遗传多样性

3个群体都观测到了显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象，偏离平衡的现象可能与微卫星技术本身的特异性、试验样本容量以及无效等位基因的存在有关[27]。在仿刺参的微卫星相关研究中，偏离平衡的现象普遍存在[20-24]。潘传燕等[20]利用微卫星技术对不同地域的6个仿刺参群体进行研究，在120个位点中有83个位点(69.17%)显著偏离了平衡。

遗传多样性被认为是生物多样性和生态系统多样性的基础与核心内容，与生物多样性的形成、发展和消失有着密切的关系。而最大限度地维持种内遗传多样性，则是利用种质资源的前提和基础，观测杂合度、期望杂合度、多态性信息含量均为反映群体遗传多样性的重要指标，其数值越大，说明基因丰富度越高，多样性水平越丰富。无论从多态性信息含量还是平均期望杂合度、平均观测杂合度，韩国群体的数值均为最高。表明韩国群体的遗传多样性水平较高。本试验中，中国群体并非野生群体，选育、连续自交导致的多样性水平下降是中国群体多样性水平低于韩国群体的可能原因之一。尽管如此，3个群体的多态性信息含量值均处中度多态水平，即3个群体基因变异程度处于中等水平，杂交仿刺参仍具一定的选育潜力。

谭杰等[22]应用9对微卫星引物对3个仿刺参地理群体进行分析得到的平均观测杂合度分别为0.6416、0.6595、0.5824，高于本试验的平均观测杂合度数值，该研究的试验群体均为野生群体，本试验除韩国群体是野生群体外，均为养殖群体，野生群体的多样性水平一般要高于养殖群体。李红梅等[28]应用自行开发的微卫星标记引物对3个野生群体及2个养殖群体大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)进行了比对分析，得出野生群体的遗传多样性水平普遍高于养殖群体的结论。孙孝德等[24]对野生仿刺参及其两代选育群体的遗传变异情况进行了分析，3个群体的平均观测杂合度为0.6469，第二代选育群体的杂合度最低，群体杂合度随选育世代的增加呈逐代降低趋势。

表2 3个刺参群体的15个微卫星位点的遗传参数

注：标*表示Hardy-Weinberg平衡检验P值≥0.05，符合平衡，其余P值<0.05，偏离平衡.

表3 仿刺参3个群体的遗传距离和相似性指数

注：对角线上数据为遗传相似性，对角线下数据为遗传距离.

图1 基于非加权组平均法构建3个群体的聚类分析图注:CS，中国群体; HS，韩国群体; ZJ，杂交群体.图2同.

图2 3 个仿刺参群体SSR21位点的微卫星检测图谱

在群体随机交配的情况下，杂交种的杂合度一般要高于双亲，但本试验中，杂交参的杂合度低于双亲(比中国群体的杂合度低0.021)，出现这种现象可能与所选取的微卫星位点或样本容量有关。在本研究的15个微卫星位点上，由于样本数量的限制，所选取的亲本之一是自繁后代，遗传背景较为相似，对子代的贡献率可能比较一致，所以导致出现了杂合度并未因杂交而提高的现象。

3.2 杂种优势

根据亲缘关系的远近，杂交可分为种间杂交(不同科、亚科、属之间的杂交)和种内杂交两种。鱼类在种间杂交方面获得了不少具明显杂种优势的优良品种[29]。“丰鲤”、“荷元鲤”、“三杂交鲤”、“奥尼罗非鱼”等杂交种具有抗寒、生长快、适应性强等明显的杂交优势，是生产中推广应用较多的杂交品种，且通过杂交后代的选育培育出“建鲤”和“松浦鲤”等新品种在生产中也获得了成功[4]。但鱼类的杂种多由某科不同亚科之间或同一种亚科不同属之间的杂交获得，双亲间的远缘杂交使得鱼类的杂交获得成功，且鲜有利用近缘杂交来建立遗传变异品系并应用于生产实践的报道。相反，贝类则是在种内杂交应用中获得了成功。牡蛎的种间杂交常因种间隔离而导致杂交失败；鲍的种间杂交杂种幼虫存活率显示出负的杂种优势。海湾扇贝、皱纹盘鲍等贝类的种内群体间或系群间杂交可操作性强、易推广，获得了明显的生长优势[11]。

杂种优势的产生与亲本间的遗传差异密切相关[14]，孙灵毅等[30]认为，韩国红刺参(即本研究中的韩国群体)与中国仿刺参生长环境条件不同，有各自不同的生长特性，具有基因异质性，且二者正反交后代在生长方面表现出一定的优势。本试验通过分子生物学手段进行分析，发现中国群体与韩国群体的遗传差异较小(遗传距离为0.0990)，基因异质性体现并不明显，该结果可能与本次试验选取的遗传位点或样本容量有关。目前，在仿刺参杂交中，还未培育出可稳定遗传的杂交优良品系。张黎黎等[31]以仿刺参的2个不同地理群体——俄罗斯仿刺参及中国仿刺参为亲本进行了杂交，杂交仿刺参子一代幼参存活率及生长上表现了一定的优越性。李莉等[32]等用2个微卫星位点对中国仿刺参、日本红刺参及其杂交子代进行了分析，证明了杂交子代的等位基因均来自于双亲，但由于位点有限，杂交后代与亲本的遗传多样性信息并没有详尽的对比数据。

3.3 耐高温品系的人工选育

群体遗传多样性的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关，遗传多样性的降低可能导致生物的经济性状衰退甚至是种质退化[33]。本试验中，韩国群体的遗传多样性处于相对高的水平，中国群体的遗传多样性相对较低，而杂交后代的遗传多样性水平并未因杂交而显示出明显的变化。尽管如此，杂交后代在某些微卫星位点观测到的等位基因频率和基因型频率仍表现出与亲本的差异，说明杂交过程使后代获得了一定程度的遗传分化，中国群体与韩国群体的杂交后代具一定的选育潜力。但人工选育，尤其多代人工选育中常伴随着遗传多样性指数的降低，而保证足够大的有效亲本数量是保持群体维持较高遗传变异水平的有效手段之一，所以为保证仿刺参耐高温优势性状在杂交后代中的表达，扩大野生亲本数量也许是有效途径之一。

至于引进韩国种群后对中国仿刺参种群的危害，暂时尚无支撑结论的数据，但本研究的目的并非单纯引进新品种，而重在改良本地仿刺参性状方面的杂交，旨在通过杂交提高本地仿刺参遗传多样性，促进基因交流，获得耐高温性状。若引进该韩国种群，则还需充分评估引种后续问题后具体实施。本部分分子生物学研究为仿刺参韩国群体与中国群体杂交提供了一定的数据支撑，但由于样本量有限，一些数据还有待于在后续试验中不断的补充和完善。

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MicrosatelliteAnalysisofGeneticCharacteristicsinCrossesbetweenKoreaPopulationandChinaPopulationofSeaCucumberApostichopusjaponicus

WANG He1, WANG Tiantian1, HU Liping1, ZHAO Qiang1, SUN Guohua2, SUN Lingyi1

( 1. Yantai Fisheries Research Institute, Yantai 264003, China;2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China )

Genetic diversities of the crosses between Korea population and China population of sea cucumberApostichopusjaponicuswere studied using microsatellite DNA techniques. A total of 60 alleles were detected at 15 loci in the three populations and each locus had the alleles ranging from 3 to 9 with an average of 4, and average effective allele of 2.5855. The average observed and expected heterozygosities were found to be 0.2965 and 0.3548 in Korea population, 0.2755 and 0.5296 in China population, and 0.5574 and 0.5364 in the cross. The polymorphism information content was found to be ranged from 0.0000 to 0.8480 with an average of 0.4653 in Korea population, 0.4860 in China population, and 0.4630 in the cross. The Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) analysis revealed that the deviation was ubiquity in these three populations. There were 14 loci which had intermediate or high polymorphism information among the 15 loci, showing that the diversity level was moderate polymorphisms in the three populations. The maximal level of genetic diversity was observed in Korea population (HS), and no significant cross vigour was found in the cross (ZJ). However, there were differences in the allele frequency or genotype frequency among the populations with potentiality in breeding.

Apostichopusjaponicus; genetic diversity; hybridization; microsatellite

Q78

A

1003-1111(2016)01-0060-07

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.011

2015-06-19；

2015-09-15.

山东省科技发展计划项目(2010GHY10519)；山东省农业科技成果转化资金项目(201304).

王鹤(1985-)，女，工程师；研究方向：海洋经济动物繁育. E-mail: wanghebird@126.com. 通讯作者：孙灵毅(1963-)，女，研究员；研究方向：遗传育种. E-mail: sunly1963@163.com.