丙泊酚对鼠胚胎神经干细胞凋亡的影响及作用机制

肖华平 程其许 杨小敏

(江西省肿瘤医院麻醉科，江西 南昌 330029)



·论著·

丙泊酚对鼠胚胎神经干细胞凋亡的影响及作用机制

肖华平*程其许 杨小敏

(江西省肿瘤医院麻醉科，江西 南昌 330029)

目的:探讨丙泊酚对鼠胚胎神经干细胞凋亡的影响及作用机制。方法：选择孕14～16 d Wistar大鼠，分离培养胚胎神经干细胞，分别用5、25、50、100 μmol/L丙泊酚进行处理，同时设立脂肪乳剂组和空白对照组。采用MTT法检测细胞存活率；流式细胞术观察丙泊酚对胚胎神经干细胞凋亡的影响；提取对照组、脂肪乳剂组、50 μmol/L丙泊酚、50 μmol/L丙泊酚+caspase抑制剂培育12 h后的全细胞蛋白，Western-blot检测激活的细胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达。结果：丙泊酚可引起胚胎神经干细胞凋亡，其效应呈剂量依赖型(P<0.05)；丙泊酚处理后的胚胎神经干细胞激活的caspase-3、CytochromeC、caspase-9、caspase-8蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论：丙泊酚主要通过激活caspase依赖的内源性和外源性凋亡通路引起鼠胚胎神经干细胞凋亡。

丙泊酚；胚胎神经干细胞；流式细胞术；凋亡

丙泊酚是一种静脉全麻药，作用于GABA-A受体β亚基，广泛运用于临床麻醉和重症监护室。有报道显示，发育中的大脑反复暴露于丙泊酚会引起细胞凋亡[1]，但其引起神经凋亡的细胞内机制与信号通路目前尚不清楚。基于此，本研究通过体外培养大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)，探讨丙泊酚引起神经细胞凋亡的通路，为寻找相应的靶点，阻断细胞凋亡通路，减轻丙泊酚神经毒性作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 胚胎NSCs 分离培养

孕14～16 d Wistar大鼠10%水合氯醛麻醉后，用75 %乙醇擦拭腹部,打开腹腔，取出胚胎，剪开颅骨骨膜，取出胎鼠脑皮质，放入D-hanks液中，剥除脑膜和血管，将其剪碎，以1 000 r/min离心3 min弃上清，加入0.125 %胰蛋白酶和0.102 %乙二胺四乙酸二钠盐( EDTA)，用火焰刨光的玻璃吸管吹打数次，制成单细胞悬液，再加培养液终止消化，1 000 r/min离心10 min，加入NSCs 培养液(DMEM /F12 + 2%B27添加剂 + 1%N2添加剂 + 20 ng/mL EGF +20 ng/mL bFGF,其中含青霉素钠 200 IU/L及链霉素 100 IU/L，pH 7.4)。将细胞以1×105个/mL 接种于培养瓶中，每瓶约5 mL，置于37 ℃、体积分数为5 %CO2和95%空气条件下进行培养。隔天换液，并在倒置相差显微镜下观察、拍照。

1.2 免疫细胞化学鉴定

在细胞培养至第2代或第3代时，取一洁净灭菌载玻片，在其上滴加少量细胞悬液，置于灭菌玻璃平皿内，在饱和湿度、37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；取出用滤纸吸除多余液体，4%多聚甲醛室温固定40 min，PBS 漂洗3次，5%Normal Goat sera + 0.4%TritonX-100 室温孵育30 min；Anti-Nestin 4 ℃ 24 h;PBS 漂洗×3; Goat anti-Rabbit IgG TRITC 室温避光孵育60 min；PBS 漂洗3次，DAPI 室温孵2 min；PBS 漂洗3次、水洗1次，荧光镜检。绿色荧光阳性的细胞即为Nestin阳性神经干细胞，蓝色为DAPI染色的细胞核。

1.3 丙泊酚给药方式及分组

移除细胞培养基后，用HBSS清洗细胞1次，分别用5、25、50、100 μmol/L丙泊酚处理细胞。空白对照组细胞不给予任何干预，溶媒对照组细胞给予脂肪乳。

1.4 MTT法观察丙泊酚对鼠胚胎NSCs存活的影响

将第二代生长良好的神经球轻轻吹打成单细胞后,以5×105个/L(每孔80 μL)接种于预先用0.1%PLL包被过的96孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。按以下方式分组给药：空白对照组、脂肪乳对照组、丙泊酚不同浓度组(5、25、50、100 μmol/L)。各孔分别加入20 μL含5倍终浓度药物的神经前体细胞生长培养基。在37 ℃、5%CO2条件下继续培养24 h后,每孔加入0.5%MTT 20 μL，37 ℃、5%CO2继续培养4 h。移除培养液，每孔加入10%DMSO 100 μL，10 min结晶溶解后,在酶联免疫检测仪测定标本在A570 nm处的光吸收值。

1.5 流式细胞术观察丙泊酚对鼠胚胎NSCs凋亡的影响

将第二代生长良好的神经球轻轻吹打成单细胞后，以5×105个/L(每孔240 μL)接种于预先用0.1%PLL包被过的培养皿中,37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。按以下方式分组给药：空白对照组、脂肪乳对照组、丙泊酚不同浓度组(5 、25 、50、100 μmol/L)、50 μmol/L丙泊酚 + caspase抑制剂组。培养12 h后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤细胞2次后用400 μL Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL 7-Amino-Actinomycin 混匀，室温避光反应10 min后用流式细胞仪检测。

1.6 caspase-3、细胞色素c、caspase-9、caspase-8激活蛋白免疫印迹

将第三代的胚胎神经干细胞以1×105个/mL接种于35 mm培养皿，每皿2 mL,置于37 ℃、5%CO2和95%空气培养24 h，按以下方式分组给药：空白对照组、脂肪乳对照组、50 μmol/L丙泊酚组、50 μmol/L丙泊酚+1 μmol/L caspase 抑制剂组，培养12 h后，倒掉培养基并用冰PBS洗两遍，加入2×loading buffer(1 mmol/L PMSF)裂解全细胞蛋白，4 ℃、16 000 r/min离心30 min，取上清液，定量，分装，-80 ℃保存。蛋白定量后用Western-blot检测caspase-3、细胞色素c、caspase-9、caspase-8激活蛋白含量，每次将同批蛋白样品重复进行3次得到数值作为该次实验结果。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 胚胎NSCs分离培养及鉴定

胚胎NSCs分离培养后第二天长成大小不一的神经球，悬浮在培养液中，传代后神经球生长速度逐渐减慢。取第2代神经球贴壁培养24 h后进行神经干细胞标记蛋白Nestin免疫荧光法染色,统计3次实验，每次实验将同一个培养皿中总细胞和阳性细胞计数后计算百分比作为该次实验结果。Nestin阳性的培养的神经干细胞占所有培养细胞的比例维持在90.36～93.90%(图1)。

图1 胚胎NSCs分离培养及Nestin鉴定图

2.2 MTT结果

每次实验将96孔板的5个复孔中每个孔的MTT检测数值与同次实验未做处理组(对照组)所有MTT值的平均值(设定为100)相比后得到的百分比数，即标准化值作为该孔的实验结果。处理24 h后，各组胚胎神经干细胞数目比较，差异有统计学意义(P=0.015)，其中空白对照组和脂肪乳剂组差异无统计学意义(P>0.05)，5～100 μmol/L丙泊酚处理24 h后细胞存活率下降，且呈剂量依赖性(图2)。

注：与对照组、脂肪乳剂组比较，*P<0.01；与 5 μmol/L丙泊酚组比较，#P<0.01。

图2 各组胚胎神经干细胞存活率比较

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

各组胚胎神经干细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(P=0.000)，其中空白对照组和脂肪乳剂处理12 h后凋亡率比较，差异无统计学意义(P=0.900)，但与丙泊酚组比较，差异有统计学意义(P=0.000)。丙泊酚处理组细胞凋亡率随浓度升高而逐渐升高，50 μmol/L浓度时达到最高峰，100 μmol/L时细胞死亡率超过凋亡率。添加了caspase抑制剂的50 μmol/L丙泊酚组凋亡率显著少于单纯的50 μmol/L丙泊酚(P=0.000)，见图3。

1051041031027-AAD-A1021031041053.37%25μmol/LCD14PE-A1051041031027-AAD-A1051041031027-AAD-A1051041031027-AAD-A1021031041053.23%50μmol/LCD14PE-A1021031041056.23%100μmol/LCD14PE-A10210310410514.63%CD14PE-A1051041031027-AAD-A1051041031027-AAD-A1051041031027-AAD-A102103104105CD14PE-A1021031041051021031041055μmol/LintralipidControlCD14PE-ACD14PE-A26.30%32.87%19.13%50μmol/L+caspase

图3 各组胚胎神经干细胞凋亡比较

2.4 丙泊酚对胚胎神经干细胞凋亡通路上关键蛋白的影响

各组caspase-3、细胞色素C、caspase-9、caspase-8蛋白水平比较，差异有统计学意义(P=0.000)，其中50 μmol/L丙泊酚组caspase-3、细胞色素C、caspase-9 、caspase-8条带灰度值显著高于脂肪乳剂组与空白对照组(P=0.000)，添加抑制剂后激活的caspase-3、Cytochrome C、caspase-9 caspase-8含量显著降低(P=0.000)，见图4。

caspase-9β-actincaspase-3β-actincaspase-8β-actincycβ-actincontrolintraipid50μmol/L50μmol/L+阻controlintraipid50μmol/L50μmol/L+阻controlintraipid50μmol/L50μmol/L+阻controlintraipid50μmol/L50μmol/L+阻

图4 丙泊酚对胚胎神经干细胞凋亡通路上关键蛋白的影响

3 讨 论

越来越多数据表明，麻醉药包括异氟醚、氯胺酮也包括NO、咪唑安定、硫喷妥纳、丙泊酚、七氟醚等对未成熟大脑均有毒性作用且会引起长时期认知功能障碍[2-6]。本研究主要观察丙泊酚对体外培养的鼠胚胎神经干细胞增殖及凋亡的影响，以进一步探讨丙泊酚对发育中大脑的影响。

丙泊酚是一种高脂溶性麻醉药，在外科麻醉状态下，丙泊酚的脑内浓度超过22 μmol/L甚至达到73 μmol/L。因此本研究选用5～100 μmol/L作为实验浓度。Nestin是第Ⅵ类中间丝，是早期原始神经细胞的标志，被广泛应用于体外神经干细胞的鉴定。本研究结果显示，培养的大多数细胞呈Nestin阳性,提示我们所培养的细胞具有神经干细胞特性。MTT结果显示，随着丙泊酚剂量增加，胚胎神经干细胞存活率降低，说明丙泊酚能抑制神经细胞存活，引起细胞凋亡；流式细胞检测结果证实丙泊酚能引起细胞凋亡，并随丙泊酚剂量增加凋亡率、死亡率也逐渐增加，当浓度为100 μmol/L时，细胞死亡率超过凋亡率。这与徐晓东[7]报道的丙泊酚随剂量依赖促进对胎鼠离体海马神经元凋亡，降低细胞生存率是一致的。

凋亡主要通过内源性或者外源性途径，引起caspase激活[8]。内源性途径主要是通过下调抗凋亡bcl-2蛋白家族，比如bcl-xL可增加细胞线粒体通透性，使细胞色素C释放，激活caspase-9、caspase-3，导致凋亡损害；外源性通路由死亡受体激活，形成死亡受体复合物，包含Fas、TNF-α超家族。死亡受体复合物激活caspase-8，最后激活caspase-3，诱导凋亡[9]。已经有研究报道不同剂量的丙泊酚通过激活Caspase的表达，促进神经元细胞的凋亡[10-14]，本研究结果显示，丙泊酚不仅能激活内源性途径，上调细胞色素C和caspse-9，而且能激活外源性途径的caspase-8，最终激活caspase-3诱导凋亡，并且激活的caspase-9是caspase-8的近两倍，加入caspase抑制剂后caspase-3、细胞色素C、caspase-9 和caspase-8表达均有降低趋势，细胞凋亡数也减少，说明丙泊酚引起细胞凋亡是通过caspase依赖途径的内外源性两条途径。本研究已经明确丙泊酚能通过内外源性途径引起神经干细胞凋亡，因此应尽量避免在小儿大脑发育期使用丙泊酚，即使要用也尽量避免反复、长期使用丙泊酚。

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(本文编辑：张 辉)

Effects of Propofol on embryonic neural stem cells apoptosis and its mechanism in rats

Xiao Huaping*,Cheng Qixu,Yang Xiaomin

(DepartmentofAnesthesiology,JiangxiProvincialTumorHospital,Nanchang,Jiangxi330029,China)

Objective:To investigate the effects of Propofol on embryonic neural stem cells apoptosis and its mechanism in rats.Methods:The pregnant 14～16 d Wistar rats were included. The embryonic neural stem cells were isolated and cultured,and treated with 5,25,50 and 100 μmol/L Propofol,respectively. The fat emulsion group and the control group were established. The cell viability was measured by MTT assay. The effect of Propofol on embryonic neural stem cells apoptosis was determined by flow cytometry. After cultured for 12 h,the whole-cell proteins in the control group,fat emulsion group,50 μmol/L Propofol group,50 μmol/L Propofol+caspase inhibitor group were extracted. The protein expressions of the activated cytochrome c,caspase-3,caspase-8 and caspase-9 were determined by Western blot.Results:Propofol can cause embryonic neural stem cell apoptosis,and its effect was dose-dependent (P<0.05). The expression levels of the activated embryonic neural stem cells caspase-3,Cytochrome C,caspase-9 and caspase-8 protein were significantly increased after Propofol treatment (P<0.05). Conclusion:Propofol causes embryonic neural stem cells apoptosis mainly through the activation of caspase-dependent intrinsic and extrinsic apoptotic pathways

propofol; embryonic neural stem cells; flow cytometry; apoptosis

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.04.03

江西省自然科学基金(20122BAB215036)

R614

A

2095-9664(2016)04-0009-05

2016-06-14)

*通讯作者：Email：creasevase@126.com

*Correspondingauthor：Email：creasevase@126.com