L-苹果酸及苹果对睡眠剥夺小鼠记忆的影响

卢超银，沈雨莎，张烨，倪烨钦，印媛君

1.浙江中医药大学第二临床学院，浙江杭州310053；2.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州310053

L-苹果酸及苹果对睡眠剥夺小鼠记忆的影响

卢超银1，沈雨莎1，张烨1，倪烨钦1，印媛君2

1.浙江中医药大学第二临床学院，浙江杭州310053；2.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州310053

目的探讨不同浓度L-苹果酸以及苹果对睡眠剥夺小鼠学习记忆的影响。方法15只小鼠随机分为对照组（ICR+生理盐水组）和实验组（ICR+高、中、低浓度L-苹果酸组，ICR+苹果组）。用Morris水迷宫测出睡眠剥夺前后小鼠的空间学习记忆。结果ICR+高浓度L-苹果酸组学习记忆并没有明显改善；ICR+中、低浓度L-苹果酸组学习记忆明显改善；ICR+苹果汁组学习记忆得到明显改善，且效果优于ICR+中、低浓度L-苹果酸组。结论适当浓度的L-苹果酸和苹果都能够起到改善学习记忆的作用，但是苹果改善学习记忆的机制是否仅同L-苹果酸相关还需要进一步的研究。

睡眠剥夺；L-苹果酸；苹果；学习记忆

睡眠是维持人类许多生理功能稳态所必需的，睡眠对记忆的形成、存储等都具有重要的作用[1-3]。睡眠剥夺是指人因环境的需要丧失了所需睡眠量的状态[4]。随着现代社会的高速发展，生活节奏的日益加快，人们持续性工作的状态愈来愈普遍，继而导致了剥夺的睡眠量增加。睡眠剥夺或者睡眠抑制可引起学习记忆的损害，这一点已有广泛的研究证实[3,5-8]。邓龙祥等人的研究中[10]指出苹果中的L-苹果酸能改善睡眠剥夺的小鼠学习记忆能力。但是不同浓度的苹果酸对小鼠睡眠剥夺后空间学习记忆具体影响的不同并未有进一步的研究。且成熟的苹果中含有一定量的L-苹果酸，苹果对小鼠是否也同样能够起到改善睡眠剥夺后学习记忆的作用也未见研究。该实验拟通过研究L-苹果酸以及苹果对睡眠剥夺后大鼠学习记忆的影响，以对上述内容做进一步的探究。

1　资料和方法

1.1实验动物和分组

选用健康成年ICR小鼠17只，体重(20±2)g(浙江中医药大学实验动物中心提供)。经Morris水迷宫训练之后，筛选出成绩相近的小鼠15只，随机分为5组，每组3只。对照组：ICR+生理盐水组；实验组：ICR+高浓度（0.7 mg/mL）L-苹果酸组，ICR+中浓度（0.35 mg/mL）L-苹果酸组，ICR+低浓度（0.175 mg/mL）L-苹果酸组，ICR +苹果汁组（苹果汁为直接榨取苹果而来，未添加其他物品）。

1.2药品与仪器

Morris水迷宫(浙江中医药大学实验动物中心提供)，L-苹果酸(药品源自常茂生物化学工程有限公司，纯度为99.86%)，灌胃针等。

1.3睡眠剥夺模型的建立

实验人员于Morris水迷宫训练后一天的8:00至次日8:00这段时间内监测小鼠的活动情况，阻止小鼠入睡，以达到对小鼠进行睡眠剥夺的目的。

1.4给药

从睡眠剥夺期间开始给药，睡眠剥夺期间于下午17：00对实验组和对照组同时按0.4mL的剂量灌胃。睡眠剥夺之后，依然按分组于每天下午17：00进行灌胃，剂量同睡眠剥夺期间一样，1次/d，连续进行5 d。

1.5学习记忆的测试

用Morris水迷宫法进行小鼠学习记忆的测试。睡眠剥夺前对小鼠进行水迷宫学习训练。训练时，将小鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，采集控制仪自动记录小鼠的路线。小鼠找到平台后，让其在平台上站立10 s，然后进行下一次的训练。每只小鼠从四个入水点分别放入水池为一轮训练，训练4轮，共训练16次。训练成功的标志是小鼠已经形成一定的寻找平台的路线。淘汰训练未成功的小鼠，本实验15只小鼠训练成功，淘汰2只。对小鼠进行连续5 d灌胃后进行水迷宫测量一次。测量时，将小鼠面向池壁从4个入水点分别放入，反应时(s)取平均数，作为测试成绩，若小鼠60 s内未找到平台，则以60 s计。

1.6统计方法

2　结果

将实验组和对照组小鼠在水迷宫中的反应时数据进行单因素方差分析，结果如表1。

3　讨论

已有研究表明，睡眠对记忆的形成、储存等都有密切关系[1-3]，而睡眠剥夺会对记忆造成一定损害。鉴于睡眠剥夺对记忆的影响已有大量的实验证明，所以本实验在设计时，未设置正常对照组，即肯定了睡眠剥夺对学习记忆的不良作用。该实验中Morris水迷宫法进行小鼠学习记忆的测试显示，睡眠剥夺后，高浓度L-苹果酸灌胃组的小鼠在苹果酸灌胃后学习记忆能力并没有得到明显的改善；中、低浓度L-苹果酸灌胃组的小鼠在苹果酸灌胃后学习记忆能力得到了明显的改善；苹果汁灌胃组的小鼠在苹果汁灌胃后学习记忆能力得到了明显的改善，且改善效果优于中、低浓度苹果酸灌胃组。从总体的实验结果来看，适当的苹果酸浓度的确能够起到改善学习记忆的作用，同时苹果也的确有一定的改善学习记忆的作用。但是苹果是否仅通过L-苹果酸来改善学习记忆，即苹果中是否还存在其他可以改善学习记忆的物质还需要进行进一步的研究。

睡眠剥夺可打乱人体的生物钟，干扰脑内神经递质的含量及分布，诱导某些异常基因的特异性表达，使脑内的神经网络结构偏离平衡，从而导致学习和记忆功能障碍。海马—边缘系统中有丰富的胆碱能纤维分布，与学习记忆关系密切。睡眠剥夺后的SD大鼠学习能力明显下降，海马乙酰胆碱含量明显降低[9]。有研究表明L-苹果酸对睡眠剥夺小鼠的学习记忆能力具有明显的改善作用，可以通过改善脑组织的能量代谢，调整脑内神经递质帮助学习记忆功能的恢复[10-11]。但L-苹果酸通过影响海马乙酰胆碱来达到改善学习记忆能力作用的具体机制还有待进一步证实和研究。

表1　睡眠剥夺前后各组小鼠空间学习记忆测定的结果[（±s），s]

表1　睡眠剥夺前后各组小鼠空间学习记忆测定的结果[（±s），s]

项目睡眠剥夺前睡眠剥夺后P值生理盐水0 . 7 m g / m L L -苹果酸组0 . 3 5 m g / m L L -苹果酸组0 . 1 7 5 m g / m L L -苹果酸组苹果汁组5 6 . 9 5 ± 5 . 3 2 5 7 . 1 5 ± 8 . 9 9 0 . 9 7 5 4 9 . 3 8 ± 9 . 9 8 5 2 . 1 8 ± 7 . 1 7 0 . 7 1 4 4 8 . 8 5 ± 6 . 1 6 3 6 . 3 ± 1 6 . 4 2 0 . 2 8 4 5 1 . 7 7 ± 7 . 6 2 4 7 . 1 3 ± 2 3 . 1 7 0 . 7 5 8 5 0 . 1 8 ± 9 . 0 5 3 2 . 8 2 ± 3 . 6 1 0 . 0 3 7

实验中高浓度的苹果酸并没有起到明显的改善学习记忆的作用，可能是由于小鼠个体对苹果酸敏感度的差异，苹果酸无法作用于相应靶点来达到改善学习记忆的作用引起，也可能是由其他原因造成，该实验并未对此进行深入的研究。实验中，由于采用的样本含量较小，存在着统计学误差，建议对实验进行进一步的完善，扩大样本的含量，来为该实验的实验结果提供更可靠的数据支持。L-苹果酸及苹果对于睡眠剥夺后学习记忆功能的影响对于夜间作业人员的保健具有重要意义，提供了一条新的思路。

[1]Yoo SS，Hu PT，Gujar N，et al.A deficit in the ability to form new human memories without sleep[J].Nat Neurosci，2007，10（3）：385-392.

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Effect of L-malic Acids and Apples on the Sleep Deprivation of Memory of Mice

LU Chao-yin1,SHEN Yu-sha1,ZHANG Ye1,NI Ye-qin1,YIN Yuan-jun2
1.Second Clinical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China；2.College of Basic Medicine,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China

Objective To study the effect of different concentrations of l-malic acids and apples on the sleep deprivation of memory of mice.Methods 15 mice were randomly divided into the control group(ICR+normal saline group)and the experiment group(ICR+high,middle and low concentrations of l-malic acid group,ICR+apple group),and the spatial learning and memory of mice before and after the sleep deprivation was tested by the Morris water maze.Results The learning memory of ICR+high concentration of l-malic acid group was not obviously improved,and the learning memory of ICR+middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group was obviously improved,and the learning memory effect of ICR+apple juice group was better than that of middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group.Conclusion The appropriate concentration of l-malic acids and apple can have an effect of improving the learning memory,but whether the improvement mechanism of apples on learning memory is only related to the l-malic acid needs the further study.

Sleep deprivation;L-malic acid;Apple;Learning memory

R96

A

1672-5654（2016）11（b）-0016-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.016

2016-08-11）

卢超银（1995.7-），女，浙江临海人，本科在读，研究方向：行为医学。

印媛君（1971.11-），女，浙江浦江人，硕士研究生，副教授，研究方向：心肌缺血，邮箱：hzyyjun@126.com。