运动性心房损伤和纤维化发生过程中Smad基因和蛋白的表达变化

王世强，常 芸，饶志坚，马晓雯



运动性心房损伤和纤维化发生过程中Smad基因和蛋白的表达变化

王世强1,2，常 芸2，饶志坚2，马晓雯2

目的：探讨运动性心房纤维化发生过程中大鼠心房Smad信号通路调控分子的表达变化。方法：8周龄SD雄性大鼠48只，随机分为安静对照组和大强度运动组，每组又分为8周组、12周组和16周组，大强度组分别进行8周、12周和16周的跑台运动。采用荧光定量PCR和Western Blot检测心肌Smad-2、Smad-4和Smad-7 mRNA与蛋白的表达。结果：与安静对照组相比，大强度组Smad-2的表达有增加趋势，但无显著性差异。16周大强度运动后，Smad-4 mRNA和蛋白的表达均显著性增加(P<0.05，P<0.01)。Smad-4 mRNA的表达随着时间的延长而增加，16周大强度组显著高于8周大强度组(P<0.05)。12周和16周大强度运动后，Smad-7 mRNA和蛋白的表达均显著性降低(P<0.05)。随运动时间的延长，Smad-7 mRNA的表达逐渐降低，12和16周大强度组显著低于8周大强度组(P<0.01)。结论：长期大强度运动导致大鼠心房Smad-4的表达持续上调，而Smad-7的表达进行性降低，各型Smad之间表达失调，可能是运动性心房损伤和纤维化发生的分子病理机制。

大强度运动；心房；纤维化；Smad；心房纤颤

运动性心律失常是备受研究者关注的问题。心房纤颤是最常见的运动性心律失常，会制约运动员比赛成绩的提高，影响运动员的身体健康和生命安全[2]。研究证实，运动性心房纤颤的发生与运动的剧烈程度及累积时间有关[18]。有研究表明，长期反复大强度运动导致了心房纤维化发生，可能是运动性心房纤颤的主要病理改变[10]。本课题组前期研究也证实了16周大强度跑台运动会造成大鼠心房纤维化的发生[6,7]。进一步研究发现，长期大强度运动导致大鼠心房转化生长因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的长期高表达，可能介导了心房损伤和间质纤维化的发生过程[8]。Smad(small mother against decapentaplegic)作为TGF-β1信号转导通路的下游信号分子，与细

胞膜上TGF-β受体结合并将信号传递至细胞核内发挥生物学作用[37]。Smad在细胞外基质重塑和组织损伤修复过程中具有重要作用。研究证实，在糖尿病和心肌梗死等多种疾病诱导的心房纤维化发生过程中均存在Smad异常表达[16,25,29]。Smad在运动性心房损伤和纤维化发生中的作用，鲜见相关报道。鉴于此，本研究通过建立长期大强度运动动物模型，观察Smad(Smad-2、Smad-4和Smad-7)基因和蛋白的表达变化，以期为揭示运动性心房损伤和纤维化的发生机制提供实验依据，为运动性心房纤颤的预防和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验对象

8周龄SPF级SD大鼠购置于北京维通利华实验动物技术有限公司。在国家体育总局体育科学研究所ABSL-3级实验动物房饲养，普通啮齿类动物饲料喂养，恒温恒湿，每天光照12 h。

1.2 动物分组与运动方案

1.3 取材

运动8周、12周和16周结束后的第2天，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后摘心脏，分离出右心房，组织分为两份，经液氮速冻后存于-80℃超低温冰箱，一份用于RT-PCR，一份用于Western blot。

1.4 荧光定量PCR检测mRNA的表达

取组织放入液氮预冷的研钵中，研磨成粉末后加入Trizol裂解，加入氯仿抽提，离心后加入氯丙醇，再次离心后经75%的酒精洗涤，离心后晾干加入去离子水，测量RNA的浓度和纯度。每个样本按0.5 μg总RNA 10 μl的反应体系，采用cDNA反转试剂盒(RR370A，购于Takara生物公司)反转成cDNA后，-20℃保存。以合成的cDNA为模板，加入上下游引物，采用试剂盒(RR820A，购于Takara生物公司)在ABI 7300荧光定量检测系统进行检测。反应条件为：预变性95℃ 30 s，PCR反应95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环。数据导出后，用Excel分析处理，通过2-△△CT公式计算样本中mRNA的相对含量，其中，△△CT=(CT实验组目的基因-CT实验组内参基因)-(CT对照组目的基因-CT对照组内参基因)。采用β-actin作为参照物，所有引物均通过GenBank数据库查询设计，由上海生工生物有限公司合成。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.5 Western Blot检测蛋白的表达

组织经液氮研磨后，加入蛋白裂解液(RIPA，购于碧云天公司)和蛋白酶抑制剂(PMSF，购于碧云天公司)。离心后采用BCA法测其浓度，通过加入不同量的去离子水使所有样本蛋白总量一致，按5:1加入上样缓冲液(购于碧云天公司)，最终使总蛋白浓度为4 μg/μl。水浴锅内沸腾水煮10 min使蛋白变性。采用10%的胶，120 V恒压电泳1.5 h，200 mA恒流湿转1 h。脱脂奶粉封闭PVDF膜(购于美国Millipore公司)1 h，加入一级抗体(β-actin 浓度为1∶5 000，Smad-2和Smad-4浓度为1∶1 000，Smad-7浓度为1∶500，购于美国Abcam公司)，二级抗体(1∶5 000，购于美国Abcam公司)4℃摇床过夜。PBST洗膜后，加入发光液(购于美国Millipore公司)，放入暗匣，在暗室内X光片曝光数十秒。显影数秒，定影液定影。条带在Quantiy One软件下分析。计算目的蛋白条带和内参条带灰度值的比值。

1.6 数据采集与统计学处理

所得数据用 GraghPad Prism 6.0软件转换作图。所有数据均用SPSS 18.0进行分析处理，结果采用平均数±标准差表示，采用双因素方差分析组间差异。显著性差异选择P<0.05或P<0.01水平。

2 实验结果

2.1 Smad-2基因和蛋白的表达

Smad-2基因和蛋白的表达变化见图1、图2。与安静对照组相比，8周、12周和16周运动后，心房Smad-2 基因和蛋白的表达均有所增加，但均无显著性差异。

图1 Smad-2 mRNA的表达变化柱状图

图2 Smad-2 蛋白的表达变化示意图

2.2 Smad-4基因和蛋白的表达

Smad-4 mRNA的表达变化见图3。8周和12周运动后，和安静对照组相比，大强度组心肌Smad-4 mRNA表达均有升高趋势，但均无明显差异。16周运动后，大强度组Smad-4 mRNA表达显著高于安静对照组(P<0.05)。对比8周、12周和16周大强度组，随时间的延长，Smad-4 mRNA表达逐渐增加。16周大强度组右心房Smad-4 mRNA表达显著高于8周大强度组(P<0.05)。

图3 Smad-4 mRNA的表达变化柱状图

Smad-4蛋白的表达变化见图4。和基因的变化趋势一致，8周和12周运动后，和安静对照组相比，大强度组心肌Smad-4蛋白表达均有升高趋势，但均无明显差异。16周运动后，大强度Smad-4蛋白表达显著高于安静对照组(P<0.01)。

图4 Smad-4蛋白的表达变化示意图

2.3 Smad-7基因和蛋白的表达

Smad-7 mRNA的表达变化见图5。8周运动后，和安静对照组相比，大强度组Smad-7 mRNA表达均有降低趋势，但均无明显差异。12周和16周运动后，Smad-7 mRNA表达显著低于安静对照组(P<0.05)。对比8周、12周和16周大强度组，随着时间的延长，Smad-7 mRNA表达逐渐有降低趋势。12周和16周大强度组Smad-7 mRNA均显著低于8周大强度组(P<0.01)。

图5 Smad-7 mRNA的表达变化柱状图

和基因的变化趋势一致，Smad-7蛋白的表达变化见图6。8周运动后，和安静对照组相比，大强度组Smad-7蛋白的表达均有降低趋势，但均无明显差异。12周和16周运动后，右心房Smad-7蛋白的表达显著低于安静对照组(P<0.05)。

图6 Smad-7蛋白的表达变化示意图

3 讨论

Smad蛋白是TGF-β1的下游信号分子，包括3种：1)受体型Smad蛋白(R-Smads)，主要是Smad-2和Smad-3；2)通用Smad蛋白(Co-Smad)，主要有Smad-4；3)抑制型Smad蛋白(I-Smads)，主要有Smad-6和Smad-7[27]。活化的TGF-β1受体分子使Smad-2和Smad-3发生磷酸化，然后与Smad-4结合形成Smad复合物，该复合物随即转移至细胞核内，与各种转录因子相互作用以调节相关基因的转录。而Smad-7可与TGF-β1的受体竞争性结合，阻止R-Smad的磷酸化，从而阻断TGF-β1的效应[28]。在正常生理状态下，心肌TGF-β1/Smad 信号通路中各型Smad 分子之间精密协调。在异常情况下，R-Smads与I-Smads表达失衡是诱发纤维化的分子基础之一[14,38]。

过量的TGF-β1与细胞膜上的受体结合进而造成胞内Smad表达失衡，进一步通过促进成纤维细胞的增殖、成纤维细胞向成肌纤维细胞转化并且促进CTGF表达的增加，最终使细胞外基质的合成增加，诱导器官纤维化发生[19]。另外，TGF-β1还可通过与Smad作用后促进TIMP的表达，抑制MMP的表达和活性，MMP/TIMP的比例失调，细胞外基质降解减少，促进纤维化的发生[12]。前期研究证实，长期大强度运动诱导大鼠心房胶原蛋白含量增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例失调，心房发生纤维化[6,7]。进一步研究发现，心房TGF-β1的含量显著增加，可能是运动性心房纤维化发生的关键因子[8]。Smad蛋白是介导TGF-β1发生作用的重要调控蛋白，在运动性心房损伤和纤维化发生过程中，Smad蛋白的变化规律如何，目前鲜有相关报道。

本研究结果表明，16周大强度运动后，心房Smad-2的表达无明显变化。与本研究结果一致，Lessard等[21]研究报道，急性大强度运动后，大鼠比目鱼肌Smad-2的总蛋白无明显改变，而Smad-2蛋白磷酸化增加，可能诱导了骨骼肌ECM发生重塑，导致代谢风险因子增加和运动能力降低。也有研究发现，成纤维细胞的增殖诱导了心肌纤维化的发生，Smad-2总蛋白并未明显增加，而Smad-2蛋白的磷酸化表达上调[40]。本研究中虽未发现明显的Smad-2上调，但长期大强度运动是否可能通过增加心房Smad-2蛋白的磷酸化，进而激活TGF-β1/Smad信号通路，是后续研究需补充完善之处。

本研究还发现，16周大强度运动后，大鼠心房Smad-4的基因和蛋白表达显著增加。有研究报道，力竭运动后，大鼠肝脏Smad-4的表达增加，可能介导了过度运动导致的肝损伤过程[5]。TGF-β1可通过与细胞膜受体结合，使Smad-2和Smad-3发生磷酸化，并与Smad-4结合成复合体，进入细胞核内，调控相关基因的转录。本研究中，上调的Smad-4信号通路蛋白可能介导了由于TGF-β1增加导致的纤维化反应，在运动性心房损伤和纤维化的发生过程中可能发挥重要作用。在损伤纤维化的不同阶段，Smad-4的表达不同，可能和致病因素的持续时间和强度有关[30]。本研究还发现，随着大强度运动时间的持续，Smad-4的表达逐渐增加，在16周时出现了明显升高，这可能是造成心房发生纤维化的分子机制。与本研究结果一致，Goldstein等[15]发现，骨骼肌和心肌损伤后， Smad-4的表达增加，介导了TGF-β1促纤维化反应。而通过体内抑制Smad-4的表达后，纤维化程度降低，心肌和骨骼肌功能得到改善。李宏云等[4]发现，急性钝挫损伤后心肌发生纤维化，Smad-4的表达显著增加，而通过Smad-4基因沉默后，骨骼肌纤维化程度明显降低，减轻了瘢痕形成。研究证实，Smad-4在心肌细胞肥大到凋亡的转化过程中具有“分子开关”的作用。Smad-4的过表达增加了细胞凋亡蛋白酶caspase 3的表达，增加了bax/bcl-2的比例，介导了心肌肥大的发生，也促进了心肌细胞的凋亡进程[17]。早年研究显示，大强度运动和过度运动诱导心肌发生凋亡，可能参与了运动性心肌的重塑过程[3]。而运动性心肌细胞凋亡的发生是否和Smad-4的表达增加有关，需要进一步的研究予以证实。

Smad-7是TGF-β1/Smad信号通路中的抑制性调控分子，其可与TGF-β1的I型受体竞争性结合，阻止R-Smads的磷酸化，从而阻断TGF-β1的效应[9]。本研究发现，12周和16周大强度运动显著降低了心房Smad-7的表达。Smad-7和Smad-2之间的平衡被打破，造成Smad-2和Smad-4复合物核转位增加，纤维化因子转录增加。TGF-β1可通过下游Smad信号通路，激活胶原蛋白的合成途径，使成纤维化细胞增殖，细胞外基质的增加，诱发心房纤维化[20,35]。TGF-β1表达增加和Smad-7表达减少，促进了纤维化的发生[39]。而Smad-7高表达，可消除由TGF-β1所诱导的Smad-2的磷酸化，降低了α-SMA和CTGF等纤维化因子的表达，阻止了成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，使胶原蛋白的含量降低[31]。另外，Smad-7的降低可能使抵抗活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的作用降低。敲除Smad-7基因诱导心肌ROS升高，ROS可增加MMP-9的活性，成纤维化细胞胶原蛋白合成增加。相反，Smad-7的过表达可通过降低心肌成纤维细胞ROS的产生，通过抑制MMP-9活性，降低胶原蛋白增加，抑制纤维化的发生[36]。急性或大强度耐力运动诱导心肌中的ROS含量增加，已经被研究证实[13,22]，但其是否和Smad-7的表达降低有关，需进一步研究予以证实。

研究显示，Smad-7的表达受miR-21的调控[16,23,24]。Li等研究发现，miR-21可通过结合在Smad-7的3'-UTR端，抑制其转录水平。TGF-β1干预原代培养的成纤维细胞，成熟miR-21的表达增加，而Smad-7蛋白水平降低。敲除miR-21或Smad-7过表达均能阻遏TGF-β1诱导的纤维化发生，而miR-21的过表达或抑制Smad-7则促进了纤维化发生[23]。miR-21的过表达抑制了Smad-7蛋白转录，而胶原蛋白的含量增加，加强了TGF-β1诱导的纤维化程度[33]。Li等[24]证实，具有冠状动脉疾病的患者血液中，miR-21和TGF-β1的含量增加，而Smad-7的表达降低。上调miR-21降低了Smad-7的表达，下调miR-21则增加了Smad-7的表达。血管紧张素II可诱导miR-21表达，靶基因PTEN的表达降低，导致Smad-7的表达降低，成纤维细胞的增加，造成心肌纤维化[26]。He等[16]通过快速心房起搏建立心房纤颤模型，研究发现，心房TGF-β1和miR-21呈现高表达状态，而Smad-7的表达显著降低。体外用TGF-β1干预成年大鼠心肌成纤维细胞，发现miR-21表达增加，而Smad-7表达降低，TGF-β1抑制剂则降低了miR-21的上调。进一步研究发现，miR-21前体抑制了Smad-7，而miR-21抑制剂则促进了Smad-7的表达，提示，Smad-7可能是miR-21的作用靶基因。本研究前期结果表明，长期大强度运动导致大鼠心房miR-21呈现持续高表达，其可能是通过下调Smad-7的表达，促进心房损伤和纤维化的发生和发展[8]。

本研究还发现，与安静对照组相比，8周大强度组Smad-7表达无明显差异，而12周和16周大强度组 Smad-7的表达显著降低。大强度组之间进行比较发现，Smad-7的表达逐渐降低。与此一致，有研究表明，长期的促纤维化因子作用于心肌，Smad-7的表达随时间呈现下调趋势[1,32,34]。曹辉[1]研究显示，神经卡压造成的骨骼肌损伤纤维化过程中，Smad-7的表达随卡压时间的延长表达呈逐渐下降趋势。Wang等[32]研究也表明，心肌梗死后2周，大鼠心肌梗死区Smad-7的表达降低。而随着梗死时间的延长，Smad-7的表达逐渐降低，8周后梗死区和梗死边缘均发现Smad-7的表达降低。研究提示，在心肌纤维化发生过程中，Smad-7的表达呈现出进行性的降低，因此，Smad-7的表达水平和纤维化的程度呈负相关。

综上所述，长期大强度运动大鼠心房Smad-4的表达持续上调，而Smad-7的表达进行性降低，各型Smad之间表达失调，可能是运动性心房纤维化发生的分子病理机制。这为深入了解运动性心房纤颤的发生机制提供了实验依据。

4 结论

长期大强度运动导致大鼠心房Smad-4的表达持续上调，而Smad-7的表达进行性降低，各型Smad之间表达失调，这可能是运动性心房损伤和纤维化发生的分子病理机制。

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Expression of Smad Gene and Protein in the Development of Exercise-induced Atrial Damage and Fibrosis

WANG Shi-qiang1,2，CHANG Yun2，RAO Zhi-jian2，MA Xiao-wen2

Objectives:This study was carried out to determine the expression of smad gene and protein in the development of exercise-induced atrial fibrosis.Methods:48 adult male sprague-dawley rats,8-week old,were randomly divided into two groups:Control group(C),and Highly intensive exercise group(H).Then each group is divided into 8 weeks,12 weeks and 16 weeks group.Group H were trained for 8 weeks,12 weeks and 16 weeks of treadmill exercise respectively.mRNA and protein expression of Smad-2,Smad-4 and Smad-7 were detected by Real time PCR and Western Blot.Results:Smad-2 expression of H group has a trend of increase,but there was no significant difference,compared to control group.mRNA and protein expression of Smad-4 increased significantly after 16 week-highly-intensive exercise(P<0.05,P<0.01).Smad-4 mRNA expression increased with the extension of time,thus the Smad-4 mRNA expression of H group after 16 weeks is significantly higher than 8 weeks(P<0.05).Aftre 16 week-highly-intensive exercise,mRNA and protein expression of Smad-7 significantly decreased(P<0.05).Smad-7 mRNA and protein expression gradually reduced after 12 and 16 weeks of highly intensive exercise(P<0.05).With the extension of time,Smad-7 mRNA expression reduced gradually.Thus the Smad-4 mRNA expression of H group after 16 weeks is significantly lower than 8 weeks(P<0.01).Conclusion:Long-term highly intensive exercise caused the expression of atrial Smad-4 increase,while progressive decrease of the Smad-7,inducing disorders between Smad,Which may be the molecular pathological mechanism of exercise-induced atrial fibrosis.

highlyintensiveexercise;atrial;fibrosis;Smad;atrialfibrillation

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10.16469/j.css.201611006

2016-06-28；

2016-10-28

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务经费(15-37)。

王世强(1987-)，男，山东济宁人，讲师，博士，主要研究方向为运动心脏生理和病理，E-mail：suswsq@163.com；常芸(1957-)，女，内蒙古呼和浩特人，研究员，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动员心脏病生理与医务监督，Tel：(010)87182526，E-mai：changyun@ciss.cn；饶志坚(1989-)，男，江西上饶人，在读博士研究生，主要研究方向为运动心脏生理和病理。

1.湖南工业大学 体育学院，湖南 株洲 412000；2.国家体育总局体育科学研究所，北京 100061 1.Hunan University of Technology，Zhuzhou 412000，China；2.China Institute of Sports Science，Beijing 100061，China.

G804.5

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