葡萄干中5-羟甲基糠醛的液相色谱测定

□ 陈志强　阿依古丽　宋　钰　张　颖　吐鲁番市质量与计量检测所

葡萄干中5-羟甲基糠醛的液相色谱测定

□ 陈志强阿依古丽宋钰张颖吐鲁番市质量与计量检测所

阐述葡萄干中羟甲基糠醛检验方法和条件，并结合实验确定葡萄干中羟甲基糠醛测定的提取净化条件和色谱检测条件。本研究针对样品的前处理方法、检测和确证方法的选择和优化，建立适用于葡萄干样品的前处理方法、仪器测定方法和确证方法。

葡萄干；5-羟甲基糠醛；液相色谱；仪器条件

5-羟甲基糠醛（5-Hydroxym ethyl furfural，5-HM F）是葡萄糖、果糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的醛类化合物，具有高活性的呋喃环、芳醇、芳醛结构，其衍生物被广泛的用作真菌剂、腐蚀抑制剂、香料，并作为一种有效防治神经退行性疾病、认知损害和抗心肌缺血的心血管病药物，受到研究人员的广泛关注。食品工业中，美拉德反应和焦糖化反应也可产生羟甲基糠醛，但具有一定毒副作用，对眼、黏膜、皮肤有刺激性，过量食用会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害。

5-羟甲基糠醛的含量是衡量葡萄干品质的重要指标之一，吐鲁番是我国最大的葡萄干加工和出口基地，检测5-羟甲基糠醛的含量对于提升葡萄干品质，提升市场竞争力具有积极的意义。

1　方法

5-羟甲基糠醛的检测方法通常有控制溶液的颜色、紫外法、双波长法、杂质对照法等。5-羟甲基糠醛的最大吸收波长为284 nm，该处干扰较少，紫外法常可作为5-羟甲基糠醛检测的首选方法。如中国药典2000、BP2000、USP27和日本药局方中纳入的葡萄糖注射液，均采用紫外法测定5-羟甲基糠醛含量。如果样品中的杂质在284 nm有明显的吸收，则会干扰5-羟甲基糠醛的检测，应采用HPLC法代替。本文主要探讨HPLC法的条件。1.1 提取净化

葡萄干及其制品中主要含有糖、有机酸、色素、植物蛋白等物质，因其含糖量高需对样品进行稀释，5-羟甲基糠醛极性大，易溶于水和甲醇，故采用水稀释样品。直接稀释进样有机酸、色素干扰大，需净化待测样品。根据葡萄干的特点和5-羟甲基糠醛的化学性质，Bond Elut EN V、HLB等固相萃取柱在一定条件下对葡萄干中的羟甲基糠醛有较好的吸附，因此进一步研究这些固相萃取柱在葡萄干中5-羟甲基糠醛残留检测中的应用。实验发现，Bond Elut EN V 固相萃取柱可重复利用，且上样后流速较HLB小柱快，故选用Bond Elut EN V小柱作为净化柱。

选用Bond Elut EN V固相萃取柱（500 m g，6 m L），研究固相萃取净化时的上样量、淋洗、洗脱条件。固相萃取柱用5 m L甲醇，10 m L水活化。

1.2样品前处理

称取剪碎的葡萄干10 g加水浸泡1～2 h，放入高速组织捣碎机中，加少量水捣碎，全部转移至100 m L容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀、过滤，滤液备用。取滤液直接上样，用水淋洗，去除糖和部分有机酸。

1.3上样量

选择葡萄干滤液为检测样品，分别量取3.0、4.0、5.0、6.0 m L各3份，添加标准溶液100 μ g，上样后用水淋洗样品管和固相萃取柱，用30 m L 20%甲醇水溶液洗脱，洗脱液用水稀释定容至50 m L，进样检测，计算加标回收率，见表1。称样量为6.0 m L时，回收率明显低于其他称样量的回收率，这是由于萃取柱的载样量有限，称样大时易造成萃取柱过载，从而使回收率偏低，为保证测定结果的准确性，确定样品称样量为 5.0 m L。

表1　不同样品量加标回收率

1.4淋洗及洗脱条件

选择水作为淋洗剂，结果表明，5 m L水基本能把固相萃取柱上的糖和极性大的物质完全淋洗下来。分别研究体积比为10%、20%、30%的甲醇-水作为洗脱剂的洗脱效果，结果表明，三种比例的洗脱剂用量20 m L时，均能将5-羟甲基糠醛从SPE小柱上洗脱下来，其中30%甲醇-水洗脱杂质较多，10%和20%甲醇-水洗脱杂质少，净化效果较好。但10%甲醇-水洗脱时回收率较低，通过增大洗脱剂用量可提高回收率，说明10%甲醇-水作为洗脱剂时用量大，综合考虑选择20%甲醇-水作为洗脱剂。

1.5洗脱条件的优化

吸取5 m L葡萄干滤液样品6份，分别加入100 μ g标准品，平行处理6个固相萃取柱，按照前述活化、淋洗，分别用10、15、20、25、30 m L和35m L 20%甲醇-水洗脱，制作洗脱曲线。结果表明洗脱剂体积为20 m L时，回收率大于99%，基本能洗脱完全，洗脱曲线如图1所示，为保证不同样品均能洗脱完全，最终确定洗脱体积为25 m L。

图1　Bond Elut ENV 柱上羟甲基糠醛的洗脱曲线

1.6最终确定的提取净化方法

吸取5 m L葡萄干滤液于50 m L离心管中，加入20 m L水，充分溶解混匀，取活化好的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱（Bond Elut EN V），将样品溶液全部上样，用5 m L水洗涤样品管，洗涤液也上柱净化，再用5 m L水淋洗固相萃取柱，最后用25 m L甲醇-水洗脱，整个固相萃取过程保持流速2～3 m L/m in，收集洗脱液，用水定容至50 m L，过0.2 μ m微孔滤膜，供高效液相色谱法检测。

2　高效液相色谱条件

主要研究色谱柱和流动相，在色谱柱选择时，流动相为乙腈-水（10∶90，V/V）比较BEH C18、HSS T3色谱柱，发现使用BEH C18色谱柱时，5-羟甲基糠醛出峰过早，在1m in左右出峰，调整流动相比例仍无明显改变。而HSS T3色谱柱对极性较大的羟甲基糠醛色谱保留效果较好，所以选择HSS T3色谱柱进行下一步研究。研究流动相时，比较甲醇-水（8∶92，V/V）、乙腈-水（8∶92，V/V）的分离效果。结果发现，选用甲醇做流动相时，目标物与杂质分离较差，同时目标物出峰较晚，分析时间延长；而选用乙腈做流动相时，分离效果明显变好且分析时间缩短，故选定水和乙腈为流动相。

最终确定的液相色谱条件如下。色谱柱：W aters ACQ U ITY U PLC H SS T3柱（100 m m×2.1 m m，1.8 μ m）；流动相：乙腈-水（8∶92，V/V）等度洗脱，使用前过滤并脱气；柱温：35 ℃；样品室温度：20 ℃；检测波长：285 nm；流速：0.3 m L/m in；进样量：10 μ L。

根据样液中羟甲基糠醛的含量情况，选定与样液浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中羟甲基糠醛的响应值均应在仪器检测线性范围内，如果样液中羟甲基糠醛的含量超出检测的线性范围，则稀释后再进样。对标准工作溶液和样液等体积分时段参插进样测定，以保留时间定性，外标法定量，在给定的液相色谱荧光检测条件下，羟甲基糠醛标准溶液的液相色谱图如图2所示。

3　线性与测定低限

配制浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μ g/m L和10.0 μ g/m L的5-羟甲基糠醛系列标准溶液，按方法规定的色谱条件进样检测，并以标准浓度（X，μ g/m L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作图，同时用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线回归方程为Y=230 00X+2 778.4，线性相关系数R2为1.000 0，标准曲线如图3所示，线性关系良好。

图2　羟甲基糠醛标准溶液的超高效液相色谱图（4 μg/mL）

图3　标准曲线

表2　羟甲基糠醛的加标回收率和精密度（n=6）

4　回收率及精密度

本方法采用添加回收的方法，对葡萄干样品按表2规定的水平进行添加，每个样品添加3个水平，每个添加水平重复6次，按规定的高效液相色谱法进行测定，本方法回收率及室内精密度见表2。

5　结语

目前国际上对果汁中5-羟甲基糠醛的含量无统一的限量规定，欧盟果蔬汁饮料工业协会（AIJN）规定果汁中5-羟甲基糠醛的最大残留限量为20 m g/ L；国际果汁加工联合会（IFFJP）建议果汁中5-羟甲基糠醛的最大残留限量为5～10 m g/L，浓缩果汁中最大残留限量为25 m g/L。本检测方法标准中5-羟甲基糠醛的测定低限能达到1.0 m g/ kg，满足国内外相关限量要求，可作为葡萄干中5-羟甲基糠醛的检测依据。