血府逐瘀胶囊对模拟失重下骨骼肌萎缩的防护作用

张 淑，袁 明，吴士文

血府逐瘀胶囊对模拟失重下骨骼肌萎缩的防护作用

张 淑1，袁 明2，吴士文1

目的 探讨血府逐瘀胶囊在模拟失重状态下对骨骼肌萎缩的防护作用。方法 建立尾部悬吊大鼠模拟失重模型，30只同源同窝雄性SD大鼠随机分为对照组、尾吊组和血府逐瘀组（尾吊+血府逐瘀胶囊），每组10只。对照组正常饲养，尾吊组和血府逐瘀组均尾吊30 d。对照组及尾吊组单给予纯溶媒，血府逐瘀组给予血府逐瘀胶囊，剂量为25 mg/（kg·d），每组8:00灌胃，1次/d。（1）测量比目鱼肌湿重体质量比和横截面积。（2）应用免疫蛋白质印迹法（Western-blot）技术检测PI3K/AKT通路相关蛋白及下游分子GRP78、BAX、Cyto-c蛋白表达水平。（3）应用caspase-3 活性检测试剂盒检测caspase-3活性。结果 30只大鼠全部进入结果分析，无脱失。（1）与对照组相比，尾吊组比目鱼肌平均湿重体质量比下降了56.39%；血府逐瘀组平均湿重体质量比较单纯尾吊组增加了14.49%，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）尾吊30 d显著抑制了PI3K/AKT信号通路中PI3K、p-AKT的蛋白表达水平，与对照组比较，血府逐瘀组干预后提高了PI3K、p-AKT的表达，其中对关键蛋白p-AKT的表达影响最大，与尾吊组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）尾吊30 d比目鱼肌caspase-3酶活性显著增强，血府逐瘀组caspase-3酶活性较尾吊组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 （1）尾吊模拟失重可通过抑制PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平，增强caspase-3酶活性，导致比目鱼肌萎缩；（2）血府逐瘀胶囊可能通过提高PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平，对失重性肌萎缩起到保护作用。

失重；肌萎缩；血府逐瘀胶囊；PI3K/AKT

航天失重环境下，宇航员的身体机能会发生一系列病理变化，失重或模拟失重可引起骨骼肌（特别是抗重力肌）萎缩，进而导致肌肉收缩力降低、易疲劳性增加，严重限制了人类航天事业的发展[1]。失重性肌萎缩

的发生机制目前仍不清楚，失重条件下骨骼肌的萎缩是一个多因素相互作用的结果，临床表现复杂，发病机理涉及面广，治疗较为困难，缺少有效的防护措施。目前，主要的对抗措施有运动及功能训练、物理及药物治疗等，但各种防治措施效果并不十分理想。中药因资源丰富、价格便宜、容易获得、毒副作用小而可能成为肌萎缩干预研究的一个重要方向。有研究通过模拟失重家兔模型中骨骼肌血液循环的变化提出“血瘀症”概念，指出可以用活血化瘀类药物改善萎缩肌肉的血供来对抗，并已取得了一定的效果[2]。因此本研究以尾部悬吊的方法模拟失重模型，选用血府逐瘀胶囊，观察其是否可以对抗失重状态下骨骼肌的萎缩，分析其可能作用机制，探讨失重状态下骨骼肌萎缩的有效干预药物。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，30只，同源同窝，体重200～250 g，平均（236±12）g，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，北京维通利华实验动物中心提供动物（合格证号：2011A003）。将30只大鼠按10只/组随机分为对照组、尾吊组和血府逐瘀组（尾吊+血府逐瘀胶囊）。对照组大鼠单笼正常饲养，尾吊组和血府逐瘀组采用尾部悬吊，单笼饲养，身体长轴与水平面呈30°，后肢悬空，前肢着地，可自由进水进食[3]，悬吊30 d。对照组及尾吊组单给予纯溶媒，血府逐瘀组给予血府逐瘀胶囊，血府逐瘀组在尾吊过程中每日8：00按体重25 mg/（kg·d）灌胃给药。动物房室温保持在 20～25 ℃，人工控制照明，保持 12 h黑暗与12 h光照交替。

1.2 主要试剂及药物 一抗：PI3K、AKT、p-AKT（Ser473/Thr308）、GRP78、BAX、Cyt-c；二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、兔抗鼠IgG。所有抗体均购自Cell Signal Technology公司。血府逐瘀胶囊（天津宏仁堂药业有限公司，国药准字Z12020223）按25 mg/（kg·d）剂量蒸馏水配置。

1.3 样品制备 所有大鼠30 d后行3%戊巴比妥那45 mg/kg腹腔麻醉，称重并记录。经腹中线逐层开腹，腹主动脉取血，然后迅速取出双侧比目鱼肌，电子天平称重并记录。取右后肢近中段约15 mm植入黄耆树胶粉所制固定托上，经异戊烷过渡，存放于液氮中，冰冻切片10 μm/张。

1.4 苏木精—伊红染色法 （hematoxylin-eosin staining，HE） 冰冻切片10 μm/张，苏木精素染色10 min，蒸馏水冲洗—伊红染色2 min—常规乙醇梯度脱水—二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 免疫蛋白质印迹法（Western-blot）检测 从液氮冻存管中取出冻存的比目鱼肌约50 mg，尽可能用剪刀剪碎，转移至玻璃匀浆器中，加入提取溶液A（0.22 M甘露醇，0.07 M蔗糖，2 mM Tris，1 mM EDTA，20 mM Hepes，pH 7.2，0.4%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）200 μl，并加入100×磷酸酶抑制剂、100×cocktail、100 mM×苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）各2 μl，匀浆20～30次（PMSF为异丙醇配置，匀浆前临时加入，所有操作均在冰上进行），600 g离心90 s；收集上清，沉淀重悬，再次匀浆离心。收集合并两次上清，17 000 g 、4 ℃、15 min离心，留取上清液为胞浆蛋白[4]。采用Thermo公司生产的聚氰基丙烯酸正丁酯（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量分析。上样前按1∶4加入5×上样缓冲液（蛋白样品∶5×上样缓冲液=4∶1），煮沸5 min，30 μg蛋白样品上样，10%SDS-PAGE电泳分离后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。按说明书采用5%脱脂奶粉配置抗体，PI3K 1∶1000；AKT 1∶1000；p-AKT 1∶500； GRP78 1∶1000；BAX 1∶500，分别在4 ℃过夜孵育。第2天取出，采用TBST溶液洗膜5 min ×3次，接着孵育二抗，羊抗兔或羊抗鼠 IgG （1∶2000）室温孵育1 h；TBST洗膜 10 min×3次，ECL发光，暗室曝光，显影、定影。将PVDF 膜采用0.2 mol/L NaOH 溶液洗脱后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入 GAPDH抗体（1∶2000）4 ℃过夜孵育，TBST洗膜 5 min×3 次，羊抗兔IgG（ 1∶2000） 室温孵育1 h，洗膜后再次ECL 发光，暗室曝光。将曝光后的 X光片放入扫描仪内进行扫描，采用Image-Pro Plus6.0软件对扫描得到的蛋白条带进行光密度分析。

1.6 caspase-3 活性检测 如1.5中步骤制备胞浆蛋白，依照caspase-3 活性检测试剂盒（碧云天试剂有限公司）说明书检测caspase-3活性。

2 结 果

2.1 模拟失重对大鼠比目鱼肌湿重影响及药物干预效果 对照组大鼠比目鱼肌肉眼观察饱满红润，弹性良好。尾吊组30 d比目鱼肌明显萎缩，弹性减退，肌肉变薄，色泽苍白，重量减轻。对照组平均湿重体质量比为（0.051±0.001），尾吊组30 d后为（0.022±0.001），较对照组下降了56.39%（P＜0.05）；血府逐瘀组平均湿重体重比为（0.026±0.001），较尾吊组增加了14.49%，

差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 三组大鼠比目鱼肌湿重对比

2.2 模拟失重对大鼠比目鱼肌组织横截面积的影响及药物干预效果 如图2、图3所示：尾吊后大鼠比目鱼肌面积较对照组减小；血府逐瘀组较尾吊组面积增加，但总体仍小于对照组。对照组平均肌肉横截面积（cross-sectional area，CSA）为（2189.5±95.1） μm2，尾吊30 d后为（858.3±51.8） μm2，较对照组下降了60.79%（P＜0.05）；血府逐瘀组CSA为（1149.7±83.8）μm2，较尾吊组增加了25.34%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 三组大鼠肌肉横截面积的HE染色图像（HE×400）

图3 三组大鼠比目鱼肌组织横截面积比较

2.3 模拟失重对大鼠比目鱼肌PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响及药物干预效果 应用Western blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白表达，见图4，促进细胞凋亡的相关蛋白BAX（Bcl-2相关X蛋白）各组表达差异无统计学意义，但可见其增高趋势，Cyto-c各组表达变化差异有统计学意义（P＞0.05）。相反抑制细胞凋亡的保护性因子（PI3K、p-AKT、GRP-78）在血府逐瘀组中均较尾吊组表达增多，其中关键分子PI3K、p-AKT各组表达差异有统计学意义（P＞0.05）。

图4 三组大鼠比目鱼肌PI3K/AKT通路相关蛋白表达

2.4 模拟失重对大鼠比目鱼肌胞浆caspase-3活性的影响及药物干预效果 为进一步验证药物对尾吊后肌纤维细胞凋亡的保护作用，检测了caspase-3活性表达水平的变化。30 d尾吊后对照组与尾吊组caspase-3活性相对表达水平[（0.591±0.199） vs （11.546±1.992）]相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。血府逐瘀组与尾吊组caspase-3活性相对表达水平[（4.176±0.598）vs （11.546±1.992）]相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 三组大鼠caspase-3活性变化

3 讨 论

失重状态下骨骼肌最为显著的形态学变化是肌肉湿重及横截面积的变化。主要包括骨骼肌重量减轻、体积减小，肌纤维横截面积减小，其中抗重力肌的萎缩大于非抗重力肌，慢肌的萎缩大于快肌，尤其是下肢抗重力肌，如比目鱼肌等[6]。从本研究结果可以看出，尾吊模拟失重后大鼠比目鱼肌明显萎缩，重量减轻，弹性减退，肌纤维CSA明显减小。尾吊30 d后大鼠比目鱼肌湿重体质量比下降了56.39%，尾吊组CSA较对照组下降了60.79%，这与以往的文献[5]报道相一致，说明本研究选取的尾吊模拟失重模型较为成功。给予药物干预后大鼠比目鱼肌CSA较尾吊组增加了14.49%，差异具有统计学意义，说明血府逐瘀胶囊对模拟失重状态下大鼠比目鱼肌的萎缩有显著的治疗意义。

血府逐瘀胶囊主要成分为当归、川穹、赤芍、红花等，具有活血祛瘀，行气止痛作用。血府逐瘀胶囊对头痛、腹痛、肢体麻木、经期腹痛、微循环障碍或伴有脉弦、脉涩等症候具有明显的治疗效果。血府逐瘀胶囊主要有抑制血小板聚集，改善血液流变性及微循环，抗缺氧，镇痛，抗炎，降血脂及增强免疫功能等作用[6,7]。同时可明显升高高密度脂蛋白胆固醇，改善脂质代谢紊乱，降低动脉硬化程度，改善血液流变学各项指标，增加肝细胞血流量[8]。本研究证明了活血类药物具有抗失重状态下肌萎缩的作用，主要表现在肌肉湿重和肌纤维横截面积方面。

PI3K由催化亚基P110和调节亚基P85组成，活化的PI3K通过磷酸化磷脂酰肌醇和磷酸肌醇激酶激活AKT，AKT通过Ser473和Thr308两个氨基酸残基位点的磷酸化被激活，然后磷酸化各种转录因子，激活或抑制其下游靶蛋白Bad、GSK-3β、caspase-9、p21、NF-κB和p27等，增强抗凋亡基因和抑制凋亡基因的表达如Bcl-2家族等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡

及迁移等。活化的AKT可抑制凋亡启动蛋白caspase-9的活性，中断下游通路，抑制其促凋亡作用[9]。体外实验也同样证实了该通路参与了肌细胞的代谢合成[10]。磷酸化的AKT可抑制E3泛素连接酶MuRF1和MAFbx的转录，诱导蛋白质的合成。同时活化的PI3K/AKT通路可抑制肌抑制素myostatin的活性，从而增加骨骼肌纤维的横截面积[11]。

葡萄糖调节蛋白GRP78是热休克蛋白70家族中的成员，为内质网应激ERS的标志性分子之一[12]。内质网应激时，细胞内启动未折叠蛋白反应UPR信号途径，上调内质网伴侣蛋白协助蛋白折叠，促进错误折叠的蛋白降解，降低蛋白合成速率来减小内质网负担并促进重建内质网稳态。内质网应激首先启动生存信号，给细胞提供修复机会，不能代偿时才转而启动促凋亡机制，清除过度损坏的细胞。通过应用PI3K/AKT小分子抑制剂、质粒转染和siRNA干扰等技术研究发现，PI3K/AKT信号通路可正向调节GRP78的表达。应用PI3K的抑制剂及敲除FOXO1转录因子，活化的AKT水平和内质网伴侣蛋白急剧下降，其中GRP78蛋白表达水平下降了80%。因此，有学者认为IGF-1通过调节PI3K/AKT通路调节GRP78表达，GRP78为IGF-1/ PI3K/AKT的一个下游分子[13]，GRP78参与骨骼肌组织代谢先前已有报道[14]，本研究结果观察到尾吊30 d显著抑制了PI3K/AKT通路活性，药物干预后PI3K/AKT通路活性显著增强，活化的AKT表达增加。对应的观察到尾吊30 d后GRP78蛋白水平和转录水平表达下降，药物干预后又相应增加了其表达水平，但仍较对照组为低，并且各组间转录水平的变化具有显著性差异。这种现象说明了磷酸化AKT及GRP78表达水平变化的一致性，与既往研究结果基本一致[15]。但骨骼肌系统中具体作用途径是否是通过PI3K/AKT途径仍不清楚。在未来，笔者后续研究工作将给与特异性的阻断剂和诱导剂，来进一步验证该通路的具体作用途径。

caspase-3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，也是内质网应激凋亡的最终执行蛋白。Dupont-Versteegden等[16]研究同样观察到随着失重状态下骨骼肌萎缩的加重，通过TUNEL可以检测到阳性凋亡的增加。肌肉横截面积的萎缩在尾吊2 d后最明显，而凋亡增加最明显是在尾吊12 h 。本研究中检测到尾吊30 d模型中caspse-3活性明显增高，这与文献[17]研究结果相一致。并且下游的标志蛋白BAX的表达量与caspase-3活性增加相一致，与胞浆释放的Cyto-c变化相一致。血府逐瘀干预后可以有效抑制凋亡的产生，防止骨骼肌的萎缩。

骨骼肌细胞为多核细胞，其凋亡的过程要比经典单核细胞的凋亡途径复杂。目前多数学者及本研究仍支持失重状态下肌萎缩过程涉及肌纤维细胞的凋亡参与，并且凋亡过程可以观察到凋亡执行者caspase-3的活性增强，但仍有部分学者反对这种观点[18]。本研究结果首次证实了内质网应激参与了失重性肌萎缩的调控，但其具体的作用机制并不十分清楚，从基因水平检测到PI3K/AKT通路和内质网应激的标记蛋白GRP78相一致的变化趋势，那么PI3K/AKT及内质网应激各通路间交叉调节将是本研究下一步工作的重点。这些差异及信号转导的具体机制的深入研究，可能会进一步揭开细胞信号转导的客观本质。

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（2016-09-28 收稿 2016-10-24修回）

（责任编辑 潘奕婷）

Protective effect of Xuefu Zhuyu capsule on skeletal muscle atrophy under simulated weightlessness

ZHANG Shu1, YUAN Ming2, and WU Shiwen1. 1. Department of Neurology, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China; 2. Scientific Research Training Center for Chinese Astronauts, Beijing 100094, China

Objective To discuss the protective effect of Xuefu Zhuyu capsule on skeletal muscle atrophy under simulated weightlessness. Methods Tail-suspended rat was taken as the animal model of simulated microgravity. 30 homologous Sprague-Dawley male rats (aged 10 weeks, weighing 200-250g) were randomly divided into three groups, including control group, tail-suspended group, Xuefuzhuyu group (tail-suspended + Xuefu Zhuyu capsule). The 25 mg/(kg·d) Xuefu Zhuyu was administrated to the Xuefu Zhuyu group, while the 1ml/d solvent to the control group and tail-suspended group. All the rats received the intragastric administration at eight o'clock every day. (1) The soleus morphological changes were measured, including the wet weight of body weight, the cross-sectional area of muscle fibers. (2) The protein and mRNA expression of PI3K/AKT, and some downstream proteins such as BAX and Cyto-c were detected by Western-blot and RT-PCR. (3) The caspase-3 activity was detected by caspase-3 fluorometric assay kit. Results 30 rats were all taken in the result analysis, without any loss. (1) Compared with the control group, the wet weight of soleus muscle of the tail-suspended group decreased by 56.39%; compared with the tail-suspended group, the average wet weight of Xuefu Zhuyu group increased 14.49%, and the differences were both significant (P＜0.05). (2) After tail-suspended for 30 days, the content of P-AKT and GRP78 decreased under simulated microgravity, but the activity of Akt and GRP78 of Xuefu Zhuyu group increased compared with that of control group, and the differences was significant (P＜0.05). (3) The caspase-3 activity of soleus muscle increased after tail-suspended for 30 days. And the caspase-3 activity of Xuefu Zhuyu group was lower than that of tail-suspended group, and the differences was significant (P＜0.05). Conclusions (1) Simulated microgravity may play an important role in the soleus muscle atrophy, which increases the caspase-3 activity through inhibiting protein expression level related to the PI3K/AKT pathway. (2) Xuefu Zhuyu capsule may have protective effect on muscle atrophy induced by weightlessness by increasing protein expression level related to the PI3K/AKT pathway.

microgravity; muscle atrophy; Xuefuzhuyu capsule; PI3K/AKT

R746

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.11.005

武警总医院院内课题三类（WZ2012041）

张 淑，硕士，主治医师，E-mail：neurozhangshu@126.com

1. 100039 北京，武警总医院神经内科；

2. 100094 北京，中国航天员科研训练中心

吴士文，E-mail：wu_shiwen@yahoo.com