过氧化物模拟酶在生物检测中的应用进展

侯 玥,马 野,于源华

(长春理工大学 生命科学技术学院,吉林 长春130022)



*通讯作者

过氧化物模拟酶在生物检测中的应用进展

侯 玥,马 野,于源华*

(长春理工大学 生命科学技术学院,吉林 长春130022)

酶是自然界经过长期进化而产生的生物催化剂，天然酶作为大分子蛋白具有催化效率高、专一性强、作用条件严格的优点，被广泛应用于生物医学中。但同时它亦存在纯化难、易失活、不易储存和价格昂贵的问题。设计一种像酶那样具有高度催化功能和特异性的化合物，是科学界一直追求的目标。近年来陆续有学者采用分子合成的方法，研究出一系列比天然酶更为简单的非蛋白质小分子化合物，使其具有与天然酶相同功能，称之为模拟酶(Enzyme mimic or Artificial enzyme)。本文对过氧化物模拟酶在生物检测中的研究进展作出综述。

1 过氧化物酶模拟酶的种类

过氧化物酶(Peroxidase;POD,EC 1.11.1.x)是一类广泛存在于动物、植物、微生物中的活性物质，分子量范围35000-100000D。目前已知基因序列的过氧化物酶约有6000多种。

根据Kirby分类法，模拟酶可分为:A单纯酶模型，它是以化学方法通过模拟天然酶活性进行重建和改造酶活性；B机理酶模型，它是通过对酶作用机制的探索研究，进而指导模拟酶的设计和合成；C单纯合成酶样化合物，它由一些化学合成的具有酶的催化功能的简单分子。

1970年第一个过氧化物酶模拟酶出现[1]，当时主要侧重于对水解金属酶催化中心的模拟。1990年之后，主要对催化中心和协同作用进行研究[2,3]。

含铁的过氧化物酶(POD)是一类结构相似、功能相同的酶，它们是通过二电子还原过程对底物H2O2进行催化。同时POD还可以催化其它有机物和无机物的过氧化物[4]。按照酶催化中心结构的差异性，可将过氧化物酶模拟酶分为以含金属卟啉为活性中心的卟啉络合物模拟酶和纳米材料模拟酶两类[5-12]。

2 含金属卟啉结构的过氧化物酶模拟酶

过氧化氢测定(H2O2)是在临床诊断中具有重要的意义。许多生理重要指标(例如葡萄糖、尿酸、胆固醇等)的分析方法均与相应的过氧化氢化学量的形成相关，并依过氧化氢化学量进行计算。测量过氧化氢的最常见的方法依赖于过氧化氢的氧化作用，通过过氧化物酶(通常是辣根过氧化物酶，HRP)催化生产的有色物质用于检测光或电性能的变化[13]。 HRP作为生物催化剂具有较高的底物特异性和在温和的条件下的高效率等优点。但是，作为天然酶HRP是不稳定的，在某些条件下很容易变性(例如，在强酸性和碱性条件下，高温)或通过蛋白酶消化。此外多，制备，纯化和天然酶的存储通常费时并且昂贵。为了克服生物催化剂的稳定性和成本问题，人们作出了努力的探索。目前已经研究的过氧化物酶模拟物的候选者有血红素[14,15]，卟啉[16]，分子印迹聚合物[17,18]，脱氧核酶[19,20]，并通过实验证明已可部分或完全替代HRP。

HRP存所有含血红素的蛋白质中，它是第一个以酶活性形式被重新构建的酶[21]。Howes等研究了血红素氨基酸替代实验，发现替换血红素的蛋白质构型是影响蛋白活性的重要因素[22,23]。

血红素(Heme)是由原卟啉 (Protoporphyrin)和铁离子所形成的配合物，具有重要的生理功能。以血红素为辅基的蛋白称为血红素蛋白( Hemoproteins)，它是一类以血红素为辅基的金属蛋白质的总称，它由原卟啉与Fe2+离子组成，可完成一系列的催化反应，包括从电荷迁移、小分子转运，到氧化还原反应等[24,25]。因此，血红素和卟啉结构的无机模拟酶得到了广泛的研究[26-28]。

黄应平等[26]通过对血红蛋白进行研究，他们通过血红蛋白对H2O2-4-AAP-氯代苯酚显色体系的催化反应的实验证明，血红蛋白测定H2O2具有高的较灵敏度，具有过氧化物模拟酶的功能。其实验测定H2O2浓度为1.12×10-5mmol/L时的重复性为2.1%。用血红蛋白作为模拟酶替代过氧化物酶，与葡萄糖氧化酶组成偶联催化反应体系试剂，完成了对人血清中葡萄糖含量的测定，在葡萄糖浓度为5.44-11.0 mmol/L间的回收率为98%-106%。

席永清等[27]采用血红蛋白作为模拟酶，以L-酪氨酸(L-Tyr)作为荧光底物，组成葡萄糖氧化酶组成偶联催化反应体系试剂，建立了一种新的测定果蔬中葡萄糖浓度的方法。H2O2浓度在6.3×10-5～3.1×10-1mmol/L范围内成线性，对浓度为3.16×10-3mmol/L H2O2进行平行测定，精密度 (n=9) 3.83%。

由于酞菁类化合物母体具有与卟啉类似的结构，因此它也具有过氧化物酶的功能。陈秋影等[28]对四磺基铁酞菁(FeTSPc)作为过氧化物模拟酶的性质进行了研究，他们以FeTSPc作为模拟酶，催化H2O2与L-酪氨酸的反应，建立了测定H2O2和葡萄糖的酶动力学方法。对人血清中葡萄糖的含量进行了测定。他们将正常人葡萄糖浓度为3.9和5.5 mmol/L的血清稀释10 000倍后进行了测定，其回收率为94%-104.2%。平行6次测定的日内CV值分别为4.7%和5.0%。

韩爱霞等[29]采用肌红蛋白作为过氧化物酶模拟酶光度测定血液中葡萄糖，取得较好效果。肌红蛋白(Mb)是一种小分子蛋白质，价格POD低廉，可在较温和条件下实验。将肌红蛋白作为过氧化物酶模拟酶，催化过氧化氢氧化偶联还原型色原N-乙基-N- (2-羟基-3-磺酸基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)和4-氨基安替比林(AAP)显色反应，可应用于过氧化氢的测定。该体系与葡萄糖氧化酶(COD)催化体系偶联，实现了血液中葡萄糖含量的测定。在最佳条件下，过氧化氢的线性范围为0～5×10-5mol/L；葡萄糖测定的线性范围为1-17 mmol/L。将本法应用在血清葡萄糖测定中，回收率平均达到96.4%。

3 纳米材料模拟酶

纳米级结构材料简称为纳米材料，广义上是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围超精细颗粒材料的总称。根据2011年10月18日欧盟委员会通过的定义，纳米材料是一种由基本颗粒组成的粉状或团块状天然或人工材料，这一基本颗粒的一个或多个三维尺寸在1纳米至100纳米之间，而且纳米颗粒的总数量应占整个颗粒总数中50%以上。纳米材料由于尺寸效应、比表面积大,表面活化中心多使物质的性质发生了改变。

纳米材料作为过氧化物酶模拟物的候选物质，最近一直引发人们的极大研究兴趣。自从2007年阎锡蕴院士等首先发现Fe3O4磁性纳米微粒(NPS)材料具有类似辣根过氧化物酶的催化特性以来[30]，随继其他的一些纳米材料，包括黄金纳米粒子[31,32]、硫化亚铁纳米片[33]、磁性铁酸钴纳米颗粒[34]、氧化铜纳米粒子[35]、四氧化三钴纳米颗粒[36]、碳纳米材料[37,38]、多金属氧酸盐[39]、和RuO2NPs[40]均已发现具有过氧化物酶样活性。纳米材料作为过氧化物酶模拟物具有成本低，易于制备和高稳定性的特点，在生物医学和环境应用[41,42]许多潜在的应用的优点。

阎锡蕴课题组2007年发现了磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)具有POD的催化活性,可完成对H2O2与3.3′,5.5′-四甲基联苯胺(TMB)、重氮胺基苯(DAB)等催化反应,并生成相同的反应产物,显现出具有与辣根过氧化物酶相类似的催化功能。他们利用Fe3O4MNPs的这一特性，催化过氧化物酶底物2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)，建立了一个测定H2O2的比色方法。测定下限为3×10-3mmol/L，线性范围5×10-3～1×10-1mmol/L。进一步证实了Fe3O4MNPs具有过氧化物酶样活性[43]。

唐雨榕等[7]采用聚丙烯酸修饰的NaYF4:Yb,Er纳米粒子催化H2O2氧化TMB产生显色反应，应用于尿酸检测,显现出过氧化物模拟酶良好的催化活性。他们以TMB为研究底物，观察了不同温度和pH值对模拟酶活性的影响，并根据尿酸在尿酸氧化酶催化作用下产生H2O2的原理，将NaYF4:Yb,Er纳米粒子和尿酸氧化酶组成酶偶联试剂，建立了血尿酸浓度的比色法测定方法。在优化的条件下，血尿酸检测范围为1.0×10-2～2.0×10-1mmol/L，检出限为5.3×10-3mmol/L，并对实际样品进行测定，测定结果与临床结果一致。

Su等[6]亦观察到MFe2O4(M =镁，镍，铜)的磁性纳米颗粒有类似过氧化物酶的催化活性。MFe2O4不仅能催化H2O2产生羟基自由基氧化过氧化物酶底物产生颜色。他们利用镍铁磁性纳米粒子作模拟酶检测了葡萄糖浓度，检测范围为9.4×10-4～2.5×10-2mmol/L，检出限为4.5×10-4mmol/L，并对尿样中的葡萄糖进行检测。

Jiang等[44]发现和应用的贵金属纳米团簇得到了学者们的重视。他们报道了去铁铁蛋白配对的金簇(Au-Ft)能有效地通过催化H2O2而使TMB氧化，产生蓝色的显色反应。与天然酶相比，Au-Ft表现出更高的活性和pH、温度范围，催化的反应遵循典型的米氏动力学。由Au-Ft动力学参数表现出较低的Km值(0.097 mM)，用于TMB氧化中比活性超过比HRP。他们根据这些发现，将Au-Ft作为过氧化物模拟酶，进行了葡萄糖的酶分光光度分析。该系统表现出可接受的重复性和高特异性。

Wang X X等[45]实验证明了牛血清白蛋白(BSA)稳定的金团簇具有高度的过氧化物酶样活性。与自然酶相比较，BSA金团簇具有很强的环境适应性性，可以在很宽范围内的pH值和温度中应用。由于体积小，稳定性好，在水溶液中比其他种类的纳米粒子(如Fe3O4、FeS、氧化石墨烯等)作为过氧化物酶的模拟物有较高生物相容性，更适合生物分析。此外，他们利用BSA金团簇作为过氧化物酶模拟物检测了H2O2。他们所制备的BSA金团簇催化过氧化物酶底物，使无色3.3′,5.5′-四甲基联苯胺(TMB)3,3,5,5-tetramethylbenzidine(TMB)H2O2的氧化成显色的产品，并建立一个H2O2的比色检测方法。通过这种方法检测H2O2浓度最低可达2×10-8M，检测的线性范围从5×10-7到2×10-5M。更重要的是，开发和制备的BSA金团簇与黄嘌呤氧化酶(XOD)偶联，可建立一个敏感的和有选择性的黄嘌呤检测方法。黄嘌呤对这种检测方法的检出限为5×10-7M，该方法已成功地应用于尿液和人血清样品的测定黄嘌呤。

Caiping Ding等[46]制备的铁磁性纳米粒子(Fe3S4MNPS)显示了过氧化物酶样活性。动力学研究表明，其酶活性比其他磁性纳米材料为基础的模拟酶高很多。他们设计一个测定葡萄糖的光度分析法，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下形成过氧化氢，在Fe3S4MNPS作用下酶底物形成一个蓝色的产物。葡萄糖可在2至100 μM的浓度范围内检测，检出限为0.16 μM，并应用于人血清中葡萄糖定量分析。这种模拟酶有很大的潜力，因为它可以应用在其他氧化酶法中，而且在ELISA试剂盒中。

双抗夹心ELISA法是最常用的免疫学检测方法，其检测基础原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)。HRP标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。加入HRP标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的HRP量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入HRP反应的底物后即会产生颜色反应，通过比色法就可以测得所测定物质的含量，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于HRP的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到较高的敏感度。

HRP是ELISA免疫检测法中常用的工具酶． 但它作为一种天然酶，具有蛋白质的特性，易变性、不易储存和运输、使用成本较高。

Sushma Kumari等[47]采用缩二脲改性四酰胺铁大环配体(Fe-TAML)，合成一个非常强大的小分子HRP模拟酶，它的功能与反应速率与天然酶的HRP在水非常中接近，稳定性(pH，离子强度)远超过天然酶。这种混合材料的催化活性约是天然HRP 1000倍，比迄今为止报道金属/金属氧化物纳米颗粒HRP的模拟物高100倍。实验表明，使用这种混合材料的标记抗体是可在ELISA类型的测定法中进行检测，最重要的是，其蛋白质可以检测到fmol水平。这代表它至少高10倍于已使用的作为HRP的模拟物报道金属/金属氧化物纳米粒子，有较其它比色蛋白测定法更高的灵敏度。

普鲁士蓝(PB)Fe4[Fe(CN)6]3，作为第一代氧化酶电化学生物传感器由于其优异的电化学行为和良好的催化性能已被广泛研究。然而，近年研究显示纳米普鲁士蓝作为过氧化物酶模拟物正受到关注。

Zhang W等[48]报告的普鲁士蓝纳米粒子(Pb纳米)具有催化活性的过氧化氢(H2O2)的功能，与H2O2亲和力强，可使过氧化物酶底物2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)产生的着色产品。用PB纳米粒子作为过氧化物酶模拟物，比色法可测定浓度在0.05-50.0 μM范围的 H2O2，检测限为0.031 μM。在葡萄糖溶液中通过葡萄糖氧化酶催化氧化反应，偶联过氧化物酶模拟物实现了灵敏的检测葡萄糖浓度的比色法。葡萄糖的检测限为低至0.03 μM，线性范围为0.1-50 Μm，此方法已成功地应用于人血清中葡萄糖含量的测定。与过氧化物酶模拟物其他纳米材料相比，在H2O2和葡萄糖的检测中，PB NPS可提供10-100倍或更高的灵敏度。检测平台开发的重要性表现在医学诊断中的巨大的应用潜力。

4 小结

模拟酶由于具有价值便宜、不易失活、无需辅助因子等优点，使其成为近期的研究热点。虽然还处在应用的初始期，尚有许多理论问题待阐明，相信随着实际应用中技术和方法的改进以及科学理论的完善，过氧化物模拟酶将在生物医学等领域有非常广阔的应用。

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1007-4287(2016)11-1970-05

侯玥(1988-)，女，博士，讲师,主要从事生物技术与理论方面的研究工作;于源华(1962-)，女，教授，博士生导师，长春理工大学生命科学技术学院院长,研究方向:生物分析与检测,生物纳米材料。

2016-01-19)