AMHR2在人子宫内膜组织中的表达及相关研究

刘 磊，芦小单，林秀英，孙牧男，付建华，谭 岩，方艳秋

(吉林省人民医院 生殖医学中心，吉林 长春130021)



AMHR2在人子宫内膜组织中的表达及相关研究

刘 磊，芦小单，林秀英，孙牧男，付建华，谭 岩，方艳秋*

(吉林省人民医院 生殖医学中心，吉林 长春130021)

目的 探讨抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(AMHR2))在IVF-ET患者的子宫内膜组织着床窗口期的表达及意义。方法 采用免疫组织荧光染色检测AMHR2在IVF-ET患者黄体期子宫内膜组织中的表达情况。分离培养原代子宫内膜间质细胞，用HCG处理细胞48 h，荧光定量PCR检测HCG处理前后AMHR2基因表达情况；细胞化学染色检测HCG处理前后AMHR2蛋白表达情况。结果 AMHR2在黄体中期人子宫内膜组织表达；HCG处理后子宫内膜细胞中AMHR2的基因和蛋白水平均显著升高。结论 AMHR2在着床窗期子宫内膜间质细胞膜上表达，HCG可以增加其表达量，AMHR2可能作为预测子宫内膜容受性的参考指标。

抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体；子宫内膜容受性；体外受精移植技术

(ChinJLabDiagn,2016,20:1856)

子宫内膜容受性缺陷占导致ART技术着床失败原因的2/3，寻找子宫内膜容受窗期特异性表达的标志分子，诊断和治疗子宫内膜容受性异常具有重要的现实意义[1-3]。抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)属于TGF-β超家族成员，在卵泡发育的启动和选择性生长中发挥了重要作用，AMH的效应主要通过其Ⅱ型受体AMHR2发挥作用[4,5]。通过对VEGF调节雌性生殖器官中基因表达谱的生物信息学研究[6，7],我们发现AMHR2在子宫内膜组织中的表达水平与小鼠生殖能力的密切相关。本研究通过分析AMHR2在IVF周期患者子宫内膜中的表达的情况，探讨AMHR2参与子宫内膜容受性的可能机制，为提高IVF妊娠率提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月-2015年1月吉林省人民医院生殖医学中心行IVF-ET助孕患者32例，纳入标准：基础内分泌正常；近3个月内未服用过任何激素类药物及无宫腔操作史；B超检测子宫内膜无异常回声；输卵管无积水；排除染色体异常及传染病活动期等。

1.2 仪器和实验材料 细胞培养箱(Thermo公司)；DMEM培养基、胰蛋白酶( Gibco 公司)、小牛血清(杭州四季青生物材料公司)；人重组VEGF (R&D公司)；总RNA 提取TRIZOL 试剂盒；逆转录反应和荧光定量PCR相关试剂(Promega公司)；7500 Fast型荧光定量PCR 仪(ABI公司)；兔抗人AMHR2单克隆抗体(Santa Cruz公司)；化学发光凝胶成像系统(中国Tanon公司)。

1.3 子宫内膜组织标本获取 均于黄体期行预移植时采用一次性子宫内膜取样器，进行子宫内膜机械刺激，留取子宫内膜组织标本。子宫内膜组织分成两份，1份以4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后用于免疫荧光染色；1份用于原代培养分离间质细胞。

1.4 组织切片免疫荧光染色 石蜡切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，烘片，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，1M枸橼酸液修复，0.3%TritonX-100透膜剂透膜，滴加封闭血清，一抗4℃孵育过夜，滴加荧光二抗室温避光孵育2 h，滴加DAPI避光孵育2 min，含抗荧光淬灭剂的封片，并在荧光显微镜下立即观察。

1.5 人子宫内膜上皮细胞的分离和培养 采用酶消化和离心法在体外分离、纯化和培养原代人子宫内膜间质细胞，4%台盼蓝染色进行活细胞计数和观察细胞活力；用免疫细胞化学方法鉴定hCG(100 ng/ml)处理细胞48 h前后子宫内膜间质细胞AMHR2表达情况。

1.6 荧光定量PCR测定基因表达水平 应用TRZOL试剂盒提取子宫内膜间质细胞总RNA，逆转录，荧光定量PCR反应。引物序列为AMHR2 forward:GATTTGAGGCCTGACAGCAG,reverse:GCCAGGTGGATGGGATGTAG;18 s forward:CATTCGAACGTCTGCCCTAT,reverse:GATGTGGTAGCCGTTTCTCA。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，循环30次；72℃终延伸10 min。根据2-△△CT方法计算基因表达水平差异。

1.7 统计学分析 数据统计和作图采用GraphPad Prism5软件，两组间参数比较采用t检验，以P<0.05标记为差异性显著。

2 结果

2.1 AMHR2在子宫内膜着床窗期的表达 AMHR2主要表达在子宫内膜间质细胞胞膜，部分表达于腺体上皮细胞膜表面，见图1。

2.2 HCG对子宫内膜间质细胞的表达AMHR2的影响

分离培养原代子宫内膜间质细胞，用人促绒腺素HCG(100 ng/ml)处理细胞48 h，发现AMHR2基因表达水平显著增加，免疫组化结果显示AMHR2表达较对照组显著增加，见图2，图3。

绿色荧光为AMHR2，蓝色荧光为DAPI染色细胞核

图1 AMHR2在人子宫内膜组织的表达×200

图2 MHR2基因在体外培养的子宫内膜间质细胞的表达

图3 细胞化学染色AMHR2表达体外培养的子宫内膜间质细胞的表达

3 讨论

胚胎质量和子宫内膜容受性是影响IVF-ET技术妊娠率的关键因素。子宫内膜容受性的建立需要卵巢性激素、子宫内膜局部分子以及胚胎及其分泌的胚胎性因子等共同参与，筛选和验证对子宫容受性有诊断和治疗具有潜力的生物标记物具有重要的临床应用价值[8-10]。

AMH-AMHR2信号通路在卵巢中参与卵泡发育的2个关键性步骤，一是抑制始基卵泡的起始募集，阻止其进入生长卵泡池；通过降低卵泡对FSH的敏感性抑制窦前卵泡和小窦状卵泡的生长。AMH-AMHR2信号通路参与子宫内膜容受性的建立过程鲜有报道。

在应用新一代RNA测序技术对VEGF可逆抑制转基因小鼠模型的研究中我们发现， VEGF对AMHR2等基因在子宫表达的差异状况与小鼠生殖能力密切相关，AMH-AMHR2信号通路可能参与宫内膜容受性的建立过程。由此我们对进行IVF-ET助孕患者黄体中期子宫内膜AMHR2免疫组化结果分析发现，AMHR2主要分布在间质细胞和部分子宫内膜腺上皮细胞细胞膜。进一步通过对内膜间质细胞对HCG的反应性的结果分析发现，HCG具有显著提高间质细胞AMHR2基因和蛋白的表达水平。HCG是一种早期胚胎滋养球细胞和胎盘滋养层合体细胞分泌的糖蛋白激素，在胚胎发育、早期妊娠黄体功能维持和胚胎种植与胎盘形成过程中发挥着不可缺少的生物学作用[11-13]。临床应用研究发现，hCG宫腔灌注可以增加母-胎间血液供应、延迟子宫内膜蜕膜化进程和影响母-胎免疫过程提高辅助生殖技术临床妊娠率[14,15]。由此，我们推测AMHR2是一种具有评估子宫内膜容受性的重要分子标志物，其参与子宫内膜容受性建立的机制还有待于进一步研究。

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The expression and correlation studies of Anti?Müllerian hormone receptor 2 in endometrium undergoing IVF

LIULei,LUXiao-dan,LINXiu-ying,etal.

(ReproductiveMedicalCenter,JilinProvincePeople'sHospital,Changchun130021,China)

Objective To investigate the expression and significance of AMHR2 in the endometrium during the implantation window period of the patients with IVF-ET.Methods The expression of AMHR2 in the endometrium of IVF-ET patients during the phase of corpus phase was detected by immunofluorescence staining.The endometrial stromal cells were isolated and cultured,and the cultured cells were treated by hCG for48h.The expression of AMHR2 was detected by method of PCR and Immunohistochemical analysis.Results The expression of AMHR2 were detected in endometrial implantation window,and the levels of AMHR2 gene and protein in endometrial cells were significantly increased after HCG treatment.Conclusion AMHR2 was detected in the endometrium during the implantation window of women,and level of AMHR2 were affected by HCG.AMHR2 might be a reference index to predict endometrial receptivity.

Anti-Mullerian hormone receptor 2，Endometrial receptivity，IVF-ET

吉林省科技厅项目(20160414021GH ，20150414023GH，20150520038JH)；吉林省卫计委项目(2013Q009)

1007-4287(2016)11-1856-03

R335.5

A

2016-01-14)

*通讯作者