不同效靶比CIK对小细胞肺癌杀伤效应的实验研究

赵 鑫，常 颖，刘玉侠，赵 晖，卢卫平，于 鸿，王 斌*

(1.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012)



*通讯作者

不同效靶比CIK对小细胞肺癌杀伤效应的实验研究

赵 鑫1，常 颖1，刘玉侠2，赵 晖1，卢卫平1，于 鸿2，王 斌1*

(1.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012)

目的 探讨细胞因子杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK)与小细胞肺癌细胞NCIH-446在不同效靶比的情况下对NCIH-446的杀伤效果，为临床合理应用CIK治疗肿瘤提供科学的数据。方法 体外培养CIK细胞并鉴定，与NCIH-446细胞在50∶1,25∶1,12.5∶1的比例下进行共同培养，用xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪对两者的作用进行实时监测，共监测48 h。结果 CIK与NCIH-446在50∶1,25∶1,12.5∶1时，随着时间的延长，CIK对NCI446的杀伤作用也逐渐提高，从2 h的74.18%，67.98%，46.76%到48 h的95.00%，96.95%，93.82%。但在同一时间段3种不同比例的杀伤活性，2 h和6 h有差异(P<0.01)，13 h后同时间段的杀伤活性没有明显差异，但杀伤效果均明显提高。结论 CIK与NCIH-446在效靶比为50∶1、25∶1、12.5∶1时细胞的杀伤性在2 h，6 h时存在数量依赖关系，细胞数越高，杀伤活性越强。但随着时间的延长，这种依赖关系不明显，各种比例的细胞杀伤作用均不断增强。

CIK细胞；小细胞肺癌细胞；杀伤活性

(ChinJLabDiagn,2016,20:1808)

生物治疗在恶性肿瘤的治疗中日益受到重视，被誉为肿瘤治疗的第四大疗法。由于它具有明确的杀伤肿瘤及提高免疫力的效果，并且没有明显的副作用，对于不能手术及放化疗以及手术及放化疗后的患者是很好的治疗选择。生物治疗的细胞肿瘤很多，本实验选择CIK进行实验研究，监测其对小细胞肺癌细胞NCIH-446的杀伤作用，为CIK用于小细胞肺癌的治疗提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 IMDM培养基 购于GIBCO公司；IL-1α购于Peprotech公司;胎牛血清：购于天津康源公司；淋巴细胞分离液：购于天津灏洋生物制品科技责任有限公司；IL-2：购于北京四环生物制药有限公司；anti-CD3Ab:Biolegend公司。anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE,购自 BD公司；IFN-γ：购于天津灏洋生物制品科技责任有限公司；CD3+、CD4+、NK 、NKT 、CD3+HLA-DR+ 、CD8+CD28+荧光标记单克隆抗体：购自美国BECKMAN COULTER公司。小细胞肺癌细胞株NCIH-446：吉林省肿瘤防治研究所保存。

1.1.2 实验设备 实时无标记细胞功能分析仪XCELLigence RTCA S16，E-Plate16细胞检测板:北京昊诺斯科技有限公司提供；低温高速离心机，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培养箱，Thermo Scientific公司；流式细胞仪，BD公司。

1.2 方法

培养NCIH-446细胞：将冻存的NCI446细胞复苏、培养至对数生长期，用0.25%胰酶进行消化后，计数为6×104/ml,待用。首先向E-Plate16细胞检测板中每孔加入50 μl含10%胎牛血清的IMDM培养液在370C，5%CO2培养箱测量基线，然后取出E-Plate16板，在超净工作台内接种100 μl/孔已调好细胞数的NCIH-446。放入xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪中，再放回到37℃，5%CO2培养箱进行培养，24 h后加入不同浓度的效应细胞(CIK)，开始进行实时监测CIK细胞对NCIH-446的杀伤效应。设定指标48 h，15 min测定1次。 效应细胞CIK的制备及鉴定，见参考文献[1]。将培养10天的CIK调细胞数为3×106/ml,按以下设计加到已接种靶细胞NCIH-446的E-Plate16细胞检测板中，每孔100 μl，放入37℃。5%CO2培养箱中培养。分4组，第1组:NCIH-446；第2组:CIK1+NCIH-446(50∶1)；第3组;CIK2+NCIH-446(25∶1)；第4组：CIK3+NCIH-446(12.5∶1)。

1.3 统计学分析

应用SPSS17.0进行统计学分析，实验数据以平均值成对二样本进行T检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪监测的CIK在不同时间，不同比例对NCIH-446的杀伤效果。图中红线为NCIH-446，粉线为CIK+NCIH-446(50∶1)，蓝线为CIK+NCIH-446(25∶1)，绿线为CIK+NCIH-446(12.5∶1)。 见图1，图2。图1显示CIK对NCIH-446的杀伤作用在共同培养2个 h左右就显现出来，而且随着时间的推移，杀伤效果不断增强。图2为CIK与NCIH-446在不同比例，不同时间杀伤效果图。其中在2 h和6 h时12.5∶1的杀伤效果要低于50∶1和25∶1，统计学有差异(P<0.01)，而13 h以后，各比例的杀伤效果在同一时间点统计学上没有明显差异(P>0.05)，但总体杀伤效果是随着时间的推移逐渐提高，在48 h均达到了90%以上。

3 讨论

小细胞肺癌的治疗根据发病时间及确诊时的病情发展情况等，可以选择手术、化疗、放疗等治疗方法，但由于其恶性程度高，侵袭性强，细胞倍增时间短[2]，对于常规方法治疗后的病人，容易发生早期转移和复发[3]。生物治疗是目前肿瘤治疗的一种新的手段，它可以直接杀伤肿瘤细胞，激活免疫系统，提高免疫力，因此，对手术、化疗、放疗后免疫功能的恢复，对微小转移病灶的清除都将发挥一定作用[4]。

生物治疗细胞的种类很多，包括树突状细胞(DC)、细胞因子活化的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、T细胞，γδT细胞等。本实验选取了其中的CIK(cytokine-induced killer)细胞作为效应细胞，探讨其对小细胞肺癌的体外杀伤作用，为其临床应用提供数据。

图1 CIK对NCIH-446的杀伤作用

图2 CIK与NCIH-446在不同比例，不同时间杀伤效果(与12.5∶1相比，*P<0.01)

体外培养的CIK细胞可以表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，所以又被称为NK细胞样T淋巴细胞，因此具有T淋巴细胞强大的杀伤活性和NK细胞无MHC限制性的优点，使其应用更加广泛[5]。本实验通过不同细胞数量的CIK与小细胞肺癌NCIH-446共同培养，检测不同效靶比以及培养不同时间的CIK对NCIH-446的杀伤作用，为临床合理应用CIK细胞提供实验数据。

本实验用xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪监测CIK与NCIH-446在50∶1,25∶1,12.5∶1的不同比例下对NCIH-446的杀伤作用。本实验对杀伤作用共进行了48 h的实时监测，从监测结果可以看出，3种效靶比的CIK细胞在互相作用的2个 h开始就起作用，而且随着时间的延长，杀伤作用不断增强，从2 h的74.18%，67.98,46.76到48 h分别达到95%，96.95%，93.82%，从实验结果来看，CIK细胞对NCIH-446有较强的杀伤作用，而且这种作用会随着时间的推移不断增强，这也提示如果给病人应用CIK细胞进行治疗，由于体内的环境要好于体外环境，CIK细胞会不断增殖，杀伤效果及持续时间可能会更好。由于本实验只做了48 h的监测，只能证明在48 h内的杀伤作用是随着时间的延长，杀伤效果越好。本实验的结果为小细胞肺癌的临床治疗时细胞数量的选择提供了数据，为小细胞肺癌的治疗提供了除了手术、化疗、放疗外的一种新方法。

[1]赵 鑫，常 颖，刘玉侠，等.培养不同时间CIK细胞免疫表型变化与其抗肿瘤活性关系的研究[J].中国实验诊断学，2015,19(9)：1455.

[2]廖美琳，王慧敏.小细胞肺癌的治疗进展[J].肿瘤，2001,21(6)：399.

[3]刘 迪，樊 旼.小细胞肺癌分子遗传学研究进展[J].中国癌症杂志，2014,24(8)：630．

[4]刘清池，张慧敏，张玉娜，等.DC-CIK细胞清除微小残留白血病的临床研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2013,20(4)：398.

[5]Hontscha,Borck Y,Zhou H,et al.Clinical trials on CIK cells:First report of the international registry on CIK cells(IRCC)[J].J cancer Res Clin Oncol,2011,137(2):305.

The experimental study of CIK killing effect on small cell lung cancer in different effector target ratio

ZHAOXin,CHANGYing,LIUYu-xia,etal.

(JilinProvinceTumorHospital,Changchun130012,China)

Objective Investigate the killing effect which Cytokines killer cells(cytokine induced killer cells,CIK)have on small cell lung cancer cell NCIH-446 in different effector target ratio and provide scientific data for reasonable clinical application of CIK in cancer treatment.Methods Culture CIK cells in vitro and make the identifition,then co-culture CIK cells with NCIH-446 cells in 50∶1,25∶1,12.5∶1 proporation,monitor their effect with xCELLigence RTCA S16 unmarked cell function analyzer in real-time for 48 hours.Results When CIK and NCIH-446 are in 50∶1,25∶1,12.5∶1 proporation,the killing effect CIK has on NCI446 improves from 74.18%,67.98%,46.76% in the 2 hour to 95.00%,96.95%,93.82%in the 48 hour with the extension of time.at the same time,the killing activity in 3 different proporations differs between the 2 hour and the 6 hour(P<0.01),13 hours later,the killing activity has no significant differences but the killing effect improves obviously.95.00%,96.95%,93.82%in the 48 hour with the extension of time.at the same time,the killing activity in 3 different proporations differs between the 2 hour and the 6 hour(P<0.01),13 hours later,the killing activity has no significant differences but the killing effect improves obviously.Conclusion When CIK and NCIH-446 are in 50∶1,25∶1,12.5∶1 effector target ratio,the killing effect of cells has the number of dependencies in the 2nd and 6th hour,the higher cell number,the higher killing activity but with the extension of time,the dependency is not obvious and the killing effect of cells in different proporation is increasing.

CIK cells;small cell lung cancer cell;killing activity

1007-4287(2016)11-1808-03

R734.2

A

2016-04-14)