自体免疫细胞治疗联合化疗治疗大肠癌的临床研究

朱　卫，李佳丽，张利红，牛静秀，尹晓东，杨雪晶,3，李　敬，庞　雁，顾　林

自体免疫细胞治疗联合化疗治疗大肠癌的临床研究

朱卫1,2，李佳丽2，张利红2，牛静秀2，尹晓东2，杨雪晶2,3，李敬2，庞雁2，顾林1

目的：探讨结直肠恶性肿瘤术后化疗与树突状细胞（dendritic cells，DCs）细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）联合治疗临床应用价值。方法：选择结直肠癌术后化疗联合DC-CIK治疗的病人242例作为联合治疗组，将同期术后只进行化疗的病人463例作为单纯化疗组，分析联合治疗组的免疫功能激活状况以及生存质量，比较两组病人生存率差异。结果：在细胞治疗结束后一周对联合治疗组患者进行迟发性变态反应皮肤试验，结果显示57.85%患者免疫反应被激活，单纯治疗组在治疗过程中体力、食欲、睡眠和体重的变化情况，至少有2项生存质量指标改善的患者有185例(76.45%)。联合治疗组和单纯化疗组病人进行为期18个月的生存率对比，联合治疗组生存率为95.04%，单纯化疗组生存率为89.63%，差异显著(P=0.016)。结论：结直肠癌术后化疗联合DC-CIK治疗可以激活患者的免疫功能，改善患者的生活质量，提高生存率。

早期结直肠癌；树突状细胞疫苗；细胞因子诱导的杀伤细胞；疗效评价

结直肠癌是严重危害人民健康的常见恶性肿瘤之一，依照NCCN指南规范，早期的大肠癌治疗方法为手术，加术后10周期的标准化疗，其5年生存率始终徘徊在50%左右，一年无瘤生存率小于70%。肿瘤的规范化治疗共识是采取多学科综合治疗的方式，在传统手术、化疗、放疗的基础上与生物治疗相结合是今后抗肿瘤治疗的新途径，能延长肿瘤患者总生存期，降低死亡率[1-2]。

天津市人民医院肿瘤科基于医院数据库，开展了一系列大肠恶性肿瘤的回顾性临床研究。通过免疫迟发性变态反应迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)，生活质量，相关副反应，总生存期等方面评价DC-CIK过继免疫疗法在结、直肠恶性肿瘤中的临床价值[2-3]。

1　资料与方法

1.1一般资料搜集随访记录完整的自2012年1月—2013年12月期间，于我院进行大肠癌手术，且病理诊断为腺癌的患者。病例纳入标准：⑴大肠癌手术患者（术后予FOLFOX4辅助化疗的Dukes B期和Dukes C期患者）；⑵心、肝、肾功能和骨髓造血系统及凝血系统功能基本正常；⑶年龄在18岁～90岁（含18，90岁），男女不限；⑷既往未做过DC-CIK治疗；⑸病人愿意接受本方案治疗，自愿签署知情同意书，能按医嘱坚持用药，依从性好者，能接受医生的随访。排除标准：⑴合并有其他系统严重疾病：如肠梗阻，肠穿孔等；⑵凝血功能障碍，长期服用免疫抑制剂者；⑶外周血单核细胞计数与淋巴细胞计数之和小于1.0×109个；⑷精神病患者以及神志不清，无法语言交流的患者。孕妇，儿童排除在外；⑸合并已经明确的可能导致免疫水平变化的感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病等；并以其他疾病为突出表现，影响大肠癌证候辨证的。剔除标准：⑴严重不良反应必须停药者；⑵病人不能配合试验，自行停药，或加用其他对试验结果有影响的同类药物，其他任何原因不能完成试验者。

选取术后化疗联合DC-CIK治疗作为联合治疗组，入组病例总计242例，男性患者144例，平均年龄（63.0±10.5）岁，女性患者98例，平均年龄（62.8± 10.4）岁；同时选取同期术后只行化疗患者463例作为单纯化疗组，男性患者279例，平均年龄（63.7±12.7）岁，女性患者184例，平均年龄（64.3±10.9）岁，两组经统计学处理，分布均衡，无差异。该项临床试验获得医院伦理委员会批准并取得患者本人的同意，患者均签署知情同意书。

2方法

2.1DC-CIK治疗

2.1.1肿瘤抗原将人结肠腺癌LoVo细胞株、人直肠腺癌SW480细胞株经超声破碎后，以600 g离心30 min，收集细胞裂解液上清，即为肿瘤抗原，经0.22 μm滤器除菌后，共DCs致敏时使用。

2.1.2细胞培养DC-CIK的采集，在心电图检测下，使用德国Fresenius公司的血细胞分离机采集患者的外周血单个核细胞，在RPMI 1640培养液中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱内培养2 h后，分离悬浮细胞和贴壁细胞。贴壁细胞加入含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)的RPMI 1640培养液，置于37℃，5%CO2细胞培养箱内培养。每3 d半量换液1次，并在第5 d加入肿瘤抗原，第6 d加入TNF-α，继续培养至第7 d，即可收获致命的Ag-DCs。悬浮细胞经离心洗涤后，用RPMI 1640培养液调整密度为1× 106个/mL，转入2000 mL细胞培养袋内，加入IFN-γ，置于37℃，5%CO2细胞培养箱内培养。24 h后，加入CD3单克隆抗体和rhIL-2继续培养。之后每3 d加液1次，调整细胞密度为1×106个/mL。培养至第11 d后，即可获得CIK细胞。

1.2.3质量控制细胞培养过程中使用显微镜观察并记录相应细胞的增殖及有无污染状况；细胞收集前48 h进行细菌、真菌培养；细胞回输前1 h进行内毒素检测。且首次回输细胞活率≥95%，DC细胞每次回输细胞数静脉输注≥1×107个，DC细胞每次回输细胞数皮内输注≥1×106个，CIK细胞每次回输细胞数≥1×109个[2-3]。

1.2.4回输方案患者于采血后第8 d开始，每周回输,1次DC细胞，总计6次，前3次行静脉输注，后3次行皮内注射；从第11 d开始，每日回输1次CIK细胞，连续回输4 d。

1.3疗效评估联合治疗患者完成最后一次DC细胞回输后7 d，进行DTH测试，作为DC-CIK治疗免疫激活的指标，同时跟踪联合治疗患者生活质量和治疗过程中产生的副作用，并研究联合治疗组合单纯化疗组的生存期。采用Kaplan-Meier法分析两组患者的生存数据[4-6]。

2　结果与分析

2.1免疫反应所有242名进行联合治疗的患者在所有治疗结束后1周进行DTH皮肤测试，以明确细胞免疫治疗对体内参与肿瘤细胞的杀伤能力。DTH测试48 h后观察结果，见表1。

表1　联合治疗组患者DTH皮肤测试结果

从结果可以看出，有140/242（57.85%）的患者在进行DC-CIK免疫治疗过程中免疫反应被激活，而102/242(42.15%)的患者对治疗呈阴性反应。

2.2生活质量在治疗过程中，记录了全部参与联合治疗的242名患者体力、食欲、睡眠和体重的变化情况。0分=4项指标均无改善；1分=1项指标改善；2分=2项指标改善；3分=3项指标改善；4分=4项指标均有改善，记录结果见表2。

表2　联合治疗组患者生活质量变化情况

从表2中可以看出，经过联合治疗后患者生活质量均有较大幅度的改善，其中4项皆改善的有37人(15.29%)，3项指标改善有87人(35.95%)，2项指标改善的有61人(25.21%)，1项指标改善的为42人(17.35%)，未见任何改善的仅15人(6.20%)。

2.3安全性记录所有242名联合治疗组患者在做细胞免疫治疗过程中出现的发热、皮疹等副作用。其中有39例(16.12%)出现了低热(＜38.5℃)，15例(6.20%)出现了中热(38.5～39.5℃),7例(2.89%)出现了高热(＞39.5℃)；治疗过程中有8例(3.30%)出现了皮疹。对于发热患者予以退烧药、地塞米松和物理降温处理后，症状缓解；皮疹患者未经特殊治疗，自行缓解。

2.4生存率研究了联合治疗组和单纯化疗组病人为期18个月的生活状况。分别观察两组的3，6，9，18个月的生存率，联合治疗组生存率分别为99.60%，98.80%，97.90%和97.10%，总生存率为95.04%。单纯化疗组生存率分别为99.60%，97.60%，94.80%和93.30%，总生存率为89.63%，差异显著(P=0.016)。生存曲线见图1。

图1　两组患者生存曲线的比较(P=0.016，I：联合治疗组；NI：单纯化疗组）

3　讨论

手术、放疗、化疗三大常规疗法，在杀灭肿瘤组织的同时，对人体正常组织和器官也造成不同程度的损伤，在一定程度上影响患者的生活质量。虽然生物免疫治疗目前无法取代三大肿瘤常规疗法，但可提高患者自身免疫力，延长患者生存期，并提高患者的生活质量。可提高患者免疫力，激活机体免疫功能，还可以有效清除手术、放疗和化疗治疗后的残留微小病灶和休眠期肿瘤细胞[7-8]。

生物免疫疗法运用多种细胞因子来刺激、诱导，使免疫细胞在体外被激活后，再回输到患者体内，从而补充、调动、活化患者自身的免疫应答系统[3,9-10]。临床目前最常用的是DC-CIK联合疗法。DC细胞为体内功能最强大的抗原递呈细胞，在递呈抗原的同时，还诱导机体产生大量T淋巴细胞，并通过趋化效应使之迁并长期存在于肿瘤附近。CIK细胞在体外可被大量扩增，兼具T淋巴细胞的抗肿瘤活性与自然杀伤细胞的非MHC限制性杀灭肿瘤的效应，其杀瘤能力强，杀瘤谱广。CIK细胞可以释放大量细胞因子以抑制肿瘤细胞的活性，同时还可以激活机体免疫系统间接杀伤肿瘤细胞，并释放大量颗粒酶、穿孔素等细胞毒颗粒，直接杀伤肿瘤细胞，使之裂解[11-12]。

DTH是一种简单、易行、高效、廉价的经典免疫功能评价方法。DTH阳性表明DC、CIK细胞回输到患者体内后有效激活患者的免疫系统。在242例治疗过程中，有140例(57.85%)可见治疗后免疫反应被激活。机体免疫水平的提高，能有效提高机体对肿瘤的杀伤效果。患者在体力、食欲、睡眠和体重方面得到了不同程度的提高，至少2项指标改善多达185例(76.45%)，4项指标均无改善仅为15例(6.20%)。生物免疫治疗最大的特点是在治疗过程中无严重副作用[13-15]。在242例患者治疗过程中，仅有61例(25.21%)出现一过性发热反应，8例(3.30%)出现皮疹，经对症治疗后缓解或自行缓解。由此看出，该治疗手段展示了良好的临床应用前景。为期18个月的生存期调查显示，生物治疗联合化疗的生存率为95.04%，而仅行化疗的患者生存率为89.63%，差异显著(P=0.016)，从图1的生存期曲线也可以明显看出两者间的差异。

综上所述，DC-CIK联合化疗可以有效激活大肠癌术后患者体内免疫系统，降低化疗产生的不良反应，改善患者的生活质量，提高生存率。

4　致谢

感谢上海柯莱逊生物技术有限公司为本研究提供了免疫细胞的制备技术及方法。

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（收稿：2015-12-16修回：2016-03-10）

（责任编辑张淑坤屈振亮）

计量单位的具体要求

组合单位符号中表示相除的斜线多于1条时应采用负数幂的形式表示，组合单位中斜线和负数幂亦不可混用，如ng/kg/min应采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。量的符号一律用斜体字，如吸光度（旧称光密度）的符号为斜体字“A”。在叙述中应先列出法定计量单位数值，括号内写旧制单位数值；如果同一计量单位反复出现，可在首次出现时注出法定与旧制单位换算系数，然后只列法定计量单位数值。血压仍以mmHg表示。参量及其公差均需附单位，当参量与其公差的单位相同时，单位只写一次，如：“750.4 ng/L±18.2 ng/L”可以写作“(750.4±18.2)ng/L”。

Clinical Study of Autoimmune Cells Therapy combined with Chemotherapy for Colorectal Cancer

ZHU Wei,LI Jia-li,ZHANG Li-hong,et al.Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin (300060),China

Objective：To investigate clinical application value of dendritic cells combined with cyto⁃kine-induced killer(DC-CIK)in the treatment of colorectal cancer.MethodsTwo hundred and forty-two cas⁃es of postoperative patients of colorectal cancer treated with chemotherapy combined with DC-CIK in Tianjin People's Hospital were selected as combined treatment group,and 463 cases of colorectal cancer treated with chemotherapy were selected as control group.The type hypersensitivity delayed(DTH)skin test was performed at the end of cell therapy.The changes of physical activity,appetite and sleep were recorded.ResultsIn 57.85%of the patients in combined treatment group,DTH was activated.In the same group，there are 185 cases (76.45%)with at least 2 indexes of quality of life being improved.The combined treatment group and control group were compared in 18 months of survival.The survival rate of combined treatment group was 95.04%,and that of the control group was 89.63%.The difference was significant(P=0.016).ConclusionCombined DC-CIK cell therapy and chemotherapy can activate the immune function of patients,improve the quality of life,and improve the survival rate.

Postoperative patients of colorectalcancer;dendritic cells;cytokine-induced killer;clinicaleffects

R735.3+4

A

1007-6948(2016)02-0116-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.003

浦东新区科技发展基金（PKF2015-C12）

1.天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心（天津 300060）

2.天津市人民医院（天津 300121）

3.上海柯莱逊生物技术有限公司（上海 201201）

顾林，E-mail:gulindr@yahoo.com