实时荧光定量PCR模板核酸提取方法的比较

罗忠永，王 印，杨泽晓

(四川农业大学动物医学院动物检疫实验室，四川成都 611130)



实时荧光定量PCR模板核酸提取方法的比较

罗忠永，王 印*，杨泽晓

(四川农业大学动物医学院动物检疫实验室，四川成都 611130)

对病料核酸提取前处理方法进行优化，选择酚/氯仿法、试剂盒提取法和DNA/RNA同提取法，比较提取效果，为实验室核酸提取提供参考。配制模拟样品，通过实时荧光定量PCR比较3种方法提取效果。结果表明，提取纯度为试剂盒提取法>酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法。提取效率为酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法>试剂盒提取法。表明各提取方法效果差异显著(P<0.01)，为实验室核酸提取提供了参考。

核酸提取方法；实时荧光定量PCR；提取效果

核酸提取是分子生物学的基础，能否提取高质量的核酸分子直接关系试验的成败。1869年，Friedrich Miescher首次成功的提取了核酸[1]。经典的核酸提取主要包括密度梯度离心法、胍盐裂解法、碱裂解法、CTAB裂解法和酚抽提法[2]。目前核酸提取的研究方向是寻找特异的核酸提取材料，并逐步实现核酸提取的自动化，避免干扰；实现快速高质量的核酸自动提取；技术的关键是寻找特异的核酸提取材料，并运用工程学原理实现自动化[3-7]。基于磁性载体开发的各种磁珠法具有很好应用前景[8-12]。考虑到提取效果和成本，目前实验室应用最广的仍是胍盐裂解法和酚抽提法，结合醇或二氧化硅基质纯化法，组成了最常用的抽提试剂盒。本文比较研究酚/氯仿法、试剂盒提取法和DNA/RNA同提取法，以期为实验室核酸提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

RNAiso plus 、SYBR○Rpremix dimer eraserTM(Perfect real time)购于宝生物工程(大连)有限公司；Tris-平衡酚购于北京索莱宝科技有限公司；DP304-02 DNA 提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料核酸提取前处理方法优化 病料核酸提取前通常对病料的处理为反复冻融研磨和适当稀释，笔者在长期病料核酸提取过程中发现病料稀释对病料核酸提取效果影响很大，基于此，本实验室在病料液氮反复冻融研磨3次的基础上，使用灭菌生理盐水对病料冻融研磨液进行稀释，使用酚/氯仿法研究不同稀释度对病料核酸提取的影响，探究最适的稀释度。按病料冻融研磨液：灭菌生理盐水(V/V)=1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀释记为样品，使用改进酚/氯仿法提取样品核酸，通过观测proteinase K水浴3 h后消化情况和无水乙醇沉淀效果探究最适的稀释度。

1.2.2 3种核酸提取方法对比

1.2.2.1 模拟样品制备 PRRSV阴性样品(使用农业部推荐RT-PCR检疫标准验证)液氮反复冻融研磨3次，按病料冻融研磨液：灭菌生理盐水(V/V)=1∶4稀释，取200 μL样品加入2 μL质粒(实验室构建，核酸浓度为54.6 ng/μL)，混合均匀记为模拟样品。

1.2.2.2 模拟样品核酸提取 取模拟样品，分别使用改进酚/氯仿法[3]，天根 DP304-02试剂盒提取法(具体方法参考试剂盒说明书)和DNA/RNA同提取法[6]提取核酸，50 μL灭菌超纯水溶解制成DNA提取液。以上所有操作在同一试验中平行完成，同试验每种方法3次重复，并不同日做3次重复试验。

1.2.2.3 DNA提取液纯度测定 使用Thermo Nanodrop 2000核酸蛋白仪测定DNA提取液核酸纯度，数据使用SPSS软件统计分析。

1.2.2.4 实时荧光定量PCR法检测提取效率 利用笔者建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法(已投稿，未发表；根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计；引物序列F：ACCTCCAGATGCCGTTTGT，R：ATGTGC CGTTGACCGTAGT)检测提取效率。PCR反应体系：Dimer Eraser(Perfect real time)2×10 μL，灭菌双蒸水 6 μL，引物F(浓度10 μmol/L) 1 μL，引物R(浓度10 μmol/L) 1 μL，DNA提取液2 μL。反应条件为:95℃ 3 min；95℃ 10 s,54.4℃ 20 s，40个循环。通过标准曲线测定DNA提取液的DNA模板拷贝数,计算提取效率。

1.2.3 试验重复及数据处理 3种提取方法均在同次试验中完成，每种方法同次试验均做3次重复，并做不同日3次重复试验。试验数据使用生物学软件SPSS分析，数据处理中遵循生物统计学要求。

2 结果

2.1 病料核酸提取前处理方法优化

通过酚/氯仿法比较不同稀释度对病料核酸提取的影响。结果显示，当病料冻融研磨液灭菌生理盐水(V/V)≤1∶4时，Proteinase K可以较好地消化样品，无水乙醇沉淀后无明显杂质沉淀，提取的DNA较纯；综合考量核酸提取量和核酸提取纯度，本试验结果表明1∶4为最适稀释度(图1和图2)。

图1 Proteinase K水浴3 h消化情况

图2 无水乙醇沉淀效果

Fig.2 Precipitation effect by anhydrous alcohol

2.2 DNA提取液纯度测定

使用Thermo Nanodrop 2000核酸蛋白仪测定DNA提取液纯度，数据统计分析取，同一试验重复结果取平均值。结果显示， OD260/OD230均大于2.0，DNA提取液中有机大分子、盐离子等残留较少；以A260/A280=1.8～1.9为较好纯度[2]，改进酚/氯仿法偏移8.1%，试剂盒提取方法偏移3.7%，DNA/RNA同提取法偏移20.5%(结果见表1)。同次试验3次重复，改进酚/氯仿法差异4.7%，试剂盒提取方法差异2.0%，DNA/RNA同提取法差异6.3%，同次试验3次重复各提取方法组内数据差异不显著(P>0.05)；不同日3次重复改进酚/氯仿法差异10.3%，试剂盒提取方法差异2.3%，DNA/RNA同提取法差异15.6%，不同日3次重复组内数据试剂盒提取方法差异不显著(P>0.05)，改进酚/氯仿法差异显著(P<0.05)，DNA/RNA同提取法差异极显著(P<0.01)。提取纯度：试剂盒提取法>酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法(表1)。

表1 DNA提取液纯度测定

2.3 提取效率比较

利用笔者建立的实时荧光定量PCR方法检测提取效率；数据统计分析，同一试验重复结果取平均值。结果如下：改进酚/氯仿法提取效率：95.22%；天根DP304-02试剂盒方法提取效 率：33.88%；Trizol法提取效率：78.75%，3种提取方法提取效率差异极显著(P<0.01)；同次试验3次重复，改进酚/氯仿法差异3.9%，试剂盒提取方法差异1.3%，DNA/RNA同提取法差异4.6%，同次试验3次重复各提取方法组内数据差异不显著(P>0.05)；不同日3次重复改进酚/氯仿法差异14.7%，试剂盒提取方法差异1.4%，DNA/RNA同提取法差异14.5%，不同日3次重复组内数据试剂盒提取方法差异不显著(P>0.05)，改进酚/氯仿法和DNA/RNA同提取法差异显著(P<0.05)。提取效率：酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法>试剂盒提取法(表2)。

表2 提取效率比较

3 讨论

本试验比较不同稀释度Proteinase K消化情况和无水乙醇沉淀效果，不同稀释度各试验组结果差异显著，相对于Trizol法提取DNA，酚/氯仿法提取DNA过程各试剂处理效果容易通过Proteinase K消化情况、苯酚变性蛋白情况、无水乙醇沉淀效果观测，是比较不同稀释度对病料核酸提取影响较好的检测方法。通过纯度和效率两个方面比较提取方法的提取效果，结果显示3种核酸提取方法提取效果差异极显著(P<0.01)，酚/氯仿法提取效率最高，不受材料量的影响，但提取纯度有限，主要残留蛋白质，是由Proteinase K消化或苯酚变性蛋白质不足造成的，蛋白残留对于一些对核酸纯度要求较高的下游试验如SNP分析影响较大。天根生化科技DNA提取试剂盒利用硅胶材料在高盐离子条件下特异性地吸附核酸，低盐离子条件下解吸附，因此可以实现纯度较高的核酸提取；然而硅胶吸附材料吸附核酸量有限，提取效率较低，不适合大量样品的提取；DNA/RNA同提取法利用DNA和RNA等电点的不同分离DNA和RNA，受样品pH影响较大，提取效率和提取核酸纯度均低于酚/氯仿法，优点在于DNA/RNA同时提取，节省材料，对珍稀材料尤为适用。3次重复试验表明，酚/氯仿法和DNA/RNA同提取法重复性较差，需要试验者根据材料情况设定试剂使用量和处理时间；提取试剂盒法重复性很好，组间差异差异不显著(P>0.05)。

目前对采用的核酸提取方法主要有手工提取法和全自动仪器提取法，基层实验室较多采用的是手工提取法[6]。酚/氯仿法被实验室广泛用于DNA的提取，但存在步骤多，对操作者熟练程度要求高等缺陷[13-14]。目前市售的核酸提取试剂盒，提取的原理主要是利用特异性物质吸附核酸，然后去除杂质，洗脱获得纯净核酸[15-16]。使用胍盐裂解细胞，利用DNA和RNA等电点的不同，调节裂解液pH,加入有机溶剂氯仿实现DNA/RNA同提取，以其独特的优点得到广泛应用[17-18]。笔者对酚/氯仿法、试剂盒提取法和DNA/RNA同提取法进行研究。结果显示，3种核酸提取方法在提取核酸纯度和提取效率方面有较大差异。基于本试验结果，研究者应根据不同试验要求选择合适的核酸提取方法，才能获得满意的试验结果。

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Comparison of 3 Nucleic Acid Extraction Methods Using Real-time Fluorescent Quantitative PCR

LUO Zhong-yong，WANG Yin，YANG Ze-xiao

(AnimalQuarantineLaboratory,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Wenjiang,Chengdu,611130,China)

To obtain the appropriate nucleic acid sample，the pretreatment method for extracting nucleic acid from the disease-tissue is optimized, the extraction efficiencies of phenol/chloroform method, reagent box extraction method and extraction method with DNA and RNA were compared by simulated samples and Green I SYBR real-time PCR.The results showed that the extraction purity(Reagent box extraction method>Improved phenol/chloroform method>Extraction method with DNA and RNA)and the extraction efficiency(Improved phenol/chloroform method>Extraction method with DNA and RNA >Reagent box extraction method)were different.The experiment showed that the extraction methods had a significant difference, which provided a reference for laboratory nucleic acid extraction.

nucleic acid extraction method; real-time PCR; extraction effect

2015-10-21

“十二五”国家科技支持计划项目(2013BAD12B04)

罗忠永(1992-)，男，河南潢川人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。*通讯作者

S854.4;Q52

A

1007-5038(2016)11-0053-04