电针对小鼠慢传输型便秘模型结肠动力学影响的神经-内分泌机制研究

阮婴丹,赵征宇



电针对小鼠慢传输型便秘模型结肠动力学影响的神经-内分泌机制研究

阮婴丹1,赵征宇2

(1.台州市第一人民医院,台州 318020;2.成都中医药大学,成都 610000)

目的 通过观察电针干预下慢传输型便秘(slow transit constipation, STC)模型小鼠结肠动力学的效应改变,探讨其神经-内分泌作用机制。方法 将40只雌性昆明种小鼠随机分为A组(STC模型电针治疗组)、B组(STC模型电针预防组)、C组(STC模型对照组)和D组(空白对照组),每组10只。A组在造模成功后取上巨虚和大肠俞进行电针治疗;B组于造模开始30 d后介入电针治疗;C组和D组采用相同方法固定,不予针刺。治疗结束后采用碳末推进实验计算肠推进率,并用放免法测定小鼠结肠组织中P物质(SP)和生长抑素(SS)的含量。结果 C组小肠推进率低于D组,两组比较差异有统计学意义 (＜0.05);A组和B组肠推进率均优于C组(＜0.05);小鼠结肠组织中,C组SP含量均低于A组、B组和D组,而SS含量则均高于其他3组,差异均有统计学意义(＜0.05)。结论 电针可有效改善STC模型小鼠的结肠动力障碍问题。通过调节肠神经-内分泌系统进而改善STC模型小鼠结肠动力障碍是电针治疗STC模型小鼠的主要作用机制。

针刺疗法;电针;便秘;结肠动力学;P物质;生长抑素;慢传输型便秘

慢传输型便秘(slow transit constipation, STC),作为功能性便秘的常见类型,是指由于结肠动力障碍使内容物滞留于结肠或结肠通过缓慢的便秘,结肠测压显示结肠动力降低[1-4]。国内报道STC的发病率占功能性便秘的10.3%～45.5%,且有上升趋势[5]。

STC不仅是影响现代人生活质量的重要良性疾病之一,而且与大肠癌发病关系密切[6-9]。胃肠动力学和胃肠神经递质是目前包括STC在内的功能性胃肠疾病的研究热点,现代研究发现肠神经系统(enteric nervous system, ENS)以及肠神经递质在STC的发病中起着重要作用。在众多的肠神经递质中,肽能神经递质如兴奋性神经递质P物质(substance P, SP)和抑制性神经递质生长抑素(somatostatin, SS)在ENS病变中越来越受到关注[10-12]。

本研究采用复方地芬诺酯法复制小鼠STC模型,通过电针对模型动物结肠动力学影响的效应观察,以及对模型结肠组织中SP和SS的含量测定,初步探讨电针治疗STC的结肠动力学影响及其神经-内分泌机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理

40只雌性昆明种小鼠,体重为(20±2)g,由成都中医药大学动物实验中心提供。采用查随机数字表法将小鼠随机分为A组、B组、C组和D组,每组10只。A组、B组和C组均采用复方地芬诺酯造模,A组造模后采用电针治疗;B组造模期间采用电针治疗;C组不予以针刺治疗。D组为空白对照,采用蒸馏水灌胃,不予针刺治疗。

1.2 试剂与仪器

复方地芬诺酯片(江苏常州康普药业有限公司,0702019);阿拉伯树胶(泰安鼎力胶业有限公司);活性炭(广州金骏龙炭业化工有限公司);碘[125I]SP放免分析药盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)。

电子天平DT500(常熟市百灵天平仪器有限公司);KUBOTA高速冷冻离心机(日本九保田制造);电动玻璃匀浆机DY89-Ⅰ型(宁波新芝科器研究所);低温冰箱(无锡晟泽理化器械有限公司);G6805-2型电针仪(上海斯米达医疗器械有限公司);华佗牌针灸针(0.30 mm×13 mm,苏州医疗用品长有限公司);刻度离心管 (2 mL,上海狄氏医疗器械有限公司);SN-695B型智能放免g测量仪(上海核所日环光电仪器有限公司);LXJ-ⅡB多管离心机(常温,上海安亭科学仪器厂);DL- 5000B低温离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3 造模与治疗方法

1.3.1 复方地芬诺酯混悬液的配制[13]

取复方地芬诺酯(以盐酸地芬诺酯含量计),用研钵研碎成极细后加水配制成0.2 mg/mL的混悬液。

1.3.2 墨汁的配制[14]

称取阿拉伯树胶100 g,加水800 mL,煮沸至溶液透明,称取活性碳(粉状)50 g,加入上述溶液中煮沸3次,待溶液温度降至室温时加水定容至1000 mL。置于4℃冰箱中保存备用,用前摇匀。

1.3.3 小鼠慢传输型便秘模型制备

小鼠自由饮水投食,适应性驯养5 d后,依照文献[12-13]方法,以复方地芬诺酯20 mg/kg灌胃,连续60 d,直至小鼠粪便连续变少,便质变干、变硬。

1.3.4 治疗方法

参照《兽医针灸学》《比较解剖学》的方法取双侧上巨虚、大肠俞穴。局部常规消毒后,采用0.30 mm×13 mm毫针进行针刺,针刺深度为0.3 cm,针尾部接电针仪导线,采用疏密波,电压为3 V,频率为20～100 Hz。每日1次,每次20 min,正负电极隔日互换。B组于造模开始30 d后介入电针治疗,每星期治疗6次,间歇1 d,连续治疗8星期;A组在造模成功后进行电针治疗,每星期治疗6次,间歇1 d,连续治疗4星期。针刺时间固定于下午1～6点。所有动物均用自制笼具同法固定,C组和D组不予针刺。

1.4 观察指标

1.4.1 碳末推进实验[14]

采用碳末推进实验观察电针对小鼠肠动力的影响。小鼠禁食24 h后(不禁水),把配制好的墨汁按各鼠体重以0.2 mL/10 g灌胃,30 min后立即以断髓法处死小鼠,剖开腹腔,截取十二指肠及全段小肠(幽门至结肠回盲段),轻轻展成一直线,平铺在玻璃板上,测量幽门至碳末前沿和小肠全长的距离,计算碳末推进率。小肠推进率＝[碳末前沿至幽门的距离－小肠全长(幽门至回盲部)]×100%。

1.4.2 SP和SS含量

采用SP和SS含量变化情况观察电针对小鼠结肠中部分神经递质的影响。小鼠断髓法处死,取小鼠结肠段(降结肠距脾曲1 cm左右处取材,横结肠距脾曲1 cm左右处取材)约2 cm,反复用生理盐水冲洗,秤重并包放于铝箔纸内,置于-80℃冰箱内贮存。解冻后,立即加入生理盐水1 mL碾磨,制成匀浆(结肠组织用自动匀浆机匀浆)。4 ℃,3500 rpm离心l5 min,取上清液在-20℃低温冰箱内保存。然后采用放射免疫法测定各组动物结肠中SP与SS含量。测定方法按放免试剂盒说明书进行,由四川大学华西医学中心放射免疫科协助检测。

1.5 统计学方法

所有数据采用SPSS11.5软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,用配对检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肠推进率比较

C组小鼠肠推进率与D组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。A组和B组小鼠肠推进率与C组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。A组小鼠肠推进率与B组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠肠推进率比较 (±s,%)

表1 各组小鼠肠推进率比较 (±s,%)

组别n小肠推进率 A组10 66.25±8.031) B组10 67.61±9.171) C组1055.45±9.79 D组10 65.79±9.391)

注:与C组比较1)＜0.05

2.2 各组小鼠结肠组织中SP和SS含量比较

C组小鼠结肠组织中SP和SS含量分别与A组、B组和D组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。A组、B组和D组小鼠结肠组织中SP和SS含量组间两两比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠结肠组织中SP和SS含量比较 (±s)

表2 各组小鼠结肠组织中SP和SS含量比较 (±s)

组别nSP(pg/mL)SS(pg/mL) A组1012.7750±6.64721)18.0037±5.14661) B组1010.2472±5.34921)14.7724±4.11581) C组104.3091±1.576631.0668±11.8277 D组1013.0420±5.54051)14.8947±7.08411)

注:与C组比较1)＜0.05

3 讨论

3.1 关于便秘针灸处方(穴位)的选择

大肠俞和上巨虚是临床上治疗便秘的常用要穴。大肠俞为膀胱经经穴,亦是大肠的背俞穴,具有调理胃肠、通腑行滞之功,主治腹胀、便秘等肠道疾病。解剖位置上,大肠俞穴处布有第3腰神经皮支,深层为腰丛。现代医学认为,控制胃肠道的自主神经多数从背部脊髓T6-L2、S2-4发出,刺激相应背俞穴可通过相应自主神经调整胃肠功能。

便秘的病位在大肠,但与胃的关系密切。脾主升清,胃主降浊,为气机升降之枢纽。六腑以通为用,胃以通为顺。早在《内经》上就明确阐述了胃与大肠密不可分的关系。《灵枢·本输》:“大肠、小肠皆属于胃。”《灵枢·胀论》:“六府胀,胃胀者,腹满,胃脘痛,鼻闻焦臭,妨于食,大便难。”足阳明胃经循行腹内支脉“下循胫外廉”,上巨虚是大肠的下合穴,合治六腑。两穴共用,亦利于动物体位固定后便于电针治疗操作。

3.2 电针对STC模型小鼠结肠动力学的影响

结肠的运动功能表现为①对肠内容物进行混合、搅拌,使其附着于黏膜表面;②推送粪便使之充分吸收水分、电解质及降解产物;③暂时贮存粪便;④激发排便反射。结肠的运动具有袋状往返运动、分节推进运动、多袋推进运动、蠕动及集团运动等5种形式[15]。De Schryver AM等[16]研究认为结肠动力障碍是慢传输型便秘发生的重要原因。

碳末推进实验是目前比较常用的评价肠动力状况的效应指标。本次碳末推进实验结果表明,C组肠推进率与D组比较,差异有统计学意义(＜0.05),符合STC肠内容物通过缓慢的特点,说明本次小鼠STC模型造模成功。

针灸治疗STC疗效确切[17-21]。本实验中A组和B组结肠推进率均优于C组(＜0.05),且与D组比较均无统计学差异(＞0.05),提示实验结果与临床报道相符。说明电针疗法能通过解决结肠动力障碍问题,从而恢复正常排便功能。同时,实验还发现A组肠推进率与B组比较,差异无统计学意义(＞0.05),说明针刺介入时间的早晚对本次实验结果未见明显影响。

3.3 电针对STC模型小鼠SP和SS的影响[22-24]

P物质是最早发现的一种神经肽,属于速激肽家族。SP由神经细胞和胃肠内分泌细胞产生并分泌,广泛分布于周身各组织器官,其中中枢神经系统和胃肠道是SP存在的两个主要部位。SP可作为递质或胃肠激素释放,它对消化道平滑肌有强烈的刺激作用,增强胃肠蠕动。

SS是由14个氨基酸残基组成的环肽,因能抑制垂体前叶生长激素的释放而得名。生长抑素能神经元只在肌间神经丛中分布,能抑制胃肠平滑肌运动,延长肠道通过时间。在STC患者的结肠黏膜中,SS含量明显上升。SS还能通过特异性受体直接作用于人结肠环形肌细胞,抑制平滑肌收缩。此外,SS可以通过刺激肥大细胞释放生物活性物质影响肠道动力。

本实验结果表明,与D组比较,C组结肠组织中SP含量显著降低(＜0.05),SS含量显著升高(＜0.05),这符合两者对肠道促进和抑制的相反作用,且与相关文献报道符合。A组和B组结肠组织中SP和SS含量与D组比较,差异均无统计学意义(＞0.05),且两组间SP和SS含量比较亦无统计学差异(均＞0.05)。可见,通过电针治疗,可促进STC型小鼠肠道分泌相应的脑肠肽,以维衡持胃肠道兴奋性递质SP和抑制性递质SS之间的平衡,即恢复其正常的化学性调控,从而改善胃肠动力障碍。且针刺介入时间的早晚对调节小鼠结肠内SP和SS含量无明显影响。

ENS是一个相对独立的神经系统,接受自主神经系统(交感神经与副交感神经)的双重外来神经支配。研究结果表明上起腹部的天枢穴,下至下肢的丰隆穴,其间穴位的神经节段分布范围为T10-L5,与大肠神经节段分布相对应。因此,我们推测针刺治疗STC的可能作用机理之一是通过局部的反射弧(脊髓胸、腰段)接受躯体传入神经传入的针刺刺激信息,再由相应节段的交感神经和副交感神经整合,传至胃肠道的内在神经系统(ENS),促使肠神经元调整相应递质的释放,从而恢复紊乱的胃肠道功能,即恢复结肠运动的神经调控之一。

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Study of the Neuroendocrine Mechanism of the Action of Electroacupuncture on Colonic Motility in a Mouse Model of Slow Transit Constipation

-1,-2.

1.’,318020,; 2.,610000,

Objective To investigate the intervention effect of electroacupuncture on colonic motility in a mouse model of slow transit constipation (STC) and explore the neuroendocrine mechanism of its action. Methods Forty female Kunming mice were randomly allocated to groups A (STC model electroacupuncture treatment), B (STC model electroacupuncture prevention), C (STC model control) and D (blank control), 10 cases each. Group A received electroacupuncture at points Shangjuxu and Dachangshu after successful model making; group B, electroacupuncture at 30 days after the beginning of model making; groups C and D, no acupuncture, fastened by the same method. After the completion of treatment, intestinal propulsion rate was calculated by the charcoal powder propelling test and the substance P (SP) and somatostatin (SS) contents of mouse colon were measured by radioimmunoassay. Results Intestinal propulsion rate was lower in group C than in group D; there was a statistically significant difference between the two groups (＜0.05). Intestinal propulsion rate was higher in groups A and B than in group C (both＜0.05). The SP content of mouse colon was lower and the SS content was higher in group C than in groups A, B and D; there were statistically significant differences (＜0.05). Conclusions Electroacupuncture can effectively reduce colonic motility disorders in a mouse model of STC. The main mechanism of electroacupuncture treatment of slow transit constipation in a mouse model of STC is regulating intestinal neuroendocrine system to reduce colonic motility disorders.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Constipation; Colonic motility; Substance P; Somatostatin; Slow transit constipation

1005-0957(2016)11-1358-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.11.1358

2016-05-03

四川省自然科学基金项目

阮婴丹(1983 - ),女,主治医师

赵征宇(1968 - ),男,副教授