甲型流感病毒纯化及病毒生物学特征分析

刘 杨，赵向绒，郭春艳，胡 军，余鹏博

(1. 陕西省人民医院中心实验室，陕西西安 710068；2. 西安交通大学医学部第三附属医院，陕西西安 710068；3. 陕西省疾病预防控制中心病毒所，陕西西安 710054)



◇技术方法研究◇

甲型流感病毒纯化及病毒生物学特征分析

刘 杨1,2，赵向绒1,2，郭春艳1,2，胡 军1,2，余鹏博3

(1. 陕西省人民医院中心实验室，陕西西安 710068；2. 西安交通大学医学部第三附属医院，陕西西安 710068；3. 陕西省疾病预防控制中心病毒所，陕西西安 710054)

目的 评价蔗糖密度梯度离心纯化甲型流感病毒的方法，并对纯化的病毒颗粒特征和免疫原性进行分析。方法 接种鸡胚培养病毒，收获尿囊液，超速离心浓缩，蔗糖密度梯度离心纯化病毒，用血凝试验、蛋白定量、透射电镜和SDS-PAGE鉴定病毒颗粒。取病毒纯化产物以0.03 mg/只和0.005 mg/只分组免疫小鼠，采集小鼠血清，利用血凝抑制试验测定血清血凝抑制滴度。结果 成功利用蔗糖密度梯度离心法纯化出流感病毒，病毒原液经纯化后被分离成L、M、H三个病毒带，其中M病毒带的吸光度、蛋白浓度及血凝滴度最高，蛋白浓度可达1.2 mg/mL，血凝滴度高达1×49。电镜观察显示，L区带为具有血凝活性的质膜和结构疏松的病毒组成，M区带病毒颗粒呈球形、丝状或棒状。同时，有大量空心病毒颗粒存在。H区带与M区带类似，但未发现空心病毒颗粒。纯化的病毒免疫小鼠后可产生具有较高血凝抑制活性的抗体。结论 蔗糖密度梯度离心技术可用于流感病毒抗原的制备，且不影响病毒的免疫原性。因此，密度梯度离心法可为流感病毒的基础研究及疫苗开发提供技术支持。

甲型流感病毒；蔗糖密度梯度超速离心；免疫原性

甲型流感病毒属于正黏病毒科，流感病毒属，是引起急性呼吸道感染的病原体。疫苗接种是预防流感的有效途径[1]。目前在流感病毒抗原或疫苗制备中，主要通过层析与密度梯度离心法制备[2]，近来也有基因重组构建病毒样颗粒获取抗原[3]。本研究用传统的蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒，并对纯化的病毒进行免疫原性分析，为病毒抗原的快速制备及疫苗研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 A/PR/8/34(H1N1)病毒为本实验室保存毒株。9日龄SPF鸡胚购自北京实验动物中心。6～8周龄BALB/c小鼠购于西安交通大学医学部实验动物中心。CP90WX超速离心机购于日本日立公司。

1.2 病毒鸡胚培养 取病毒毒种用生理盐水稀释，接种9 d龄鸡胚尿囊腔作病毒培养组，另取等量生理盐水接种鸡胚作对照组，置35 ℃培养72 h后，取所有鸡胚置于4 ℃过夜，分别收获病毒培养组和对照组尿囊液[4]。用紫外照射法在4 ℃条件下灭活病毒组原液。

1.3 蔗糖密度梯度离心纯化病毒颗粒 收集原液，3 000 r/min(离心半径=10 cm)离心10 min，收集上清30 000 r/min(离心半径=9.21 cm)超速离心4 h，加入PBS(100 mmol/L，pH 7.2)重悬沉淀。将浓缩液铺入预先制备的50～600 mg/mL蔗糖密度梯度液上，用水平转头(P40ST)20 000 r/min(离心半径=15.88 cm)离心6 h。分布分层收集超速离心纯化产物，紫外可见分光光度计(NanoDrop 2 000，Thermo fisher)分别检测每层的吸光度，用BCA微量蛋白定量试剂盒(购于Thermo Fisher)对每层总蛋白浓度进行定量,具体步骤按照试剂盒说明书进行。收集的病毒层置-80 ℃保存。

1.4 透射电镜观察病毒 取病毒纯化产物滴加到铜网上，室温静置10 min，用滤纸吸干多余样品，滴加20 g/L磷钨酸负染5 min，灯下烤干铜网后置电镜下观察(西安交通大学医学部电镜室Hitachi H-600)。

1.5 动物免疫 选取6周龄BALB/c小鼠9只，分成高剂量组(0.03 mg/只)、低剂量组(0.005 mg/只)和对照组(PBS)，每组3只，经纯化的病毒抗原用PBS按不同免疫剂量稀释。常规方法免疫，采集小鼠血清并保存至4 ℃。

1.6 血凝试验和血凝抑制试验 血凝试验和血凝抑制试验具体方法参照《WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance》。

1.7 SDS-PAGE分析 分布分层收集的纯化产物按照《分子克隆实验指南(第2版)》进行蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.8 统计分析 所有数据均录入SPSS 21.0软件进行统计分析，多组均数间的比较用方差分析，多组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分层分析密度梯度离心纯化产物 蔗糖密度梯度离心后，病毒原液被分成L、M、H三个病毒带(图1)，每层以0.5 mL分布收集并检测每层的吸光度、蛋白浓度和血凝活性，共分布收集21层，其中第8层血凝滴度为1×44，但在吸光度和蛋白测定时无显著峰值(此即为L区带)。第14层(浮密度=1.181 4)的吸光度、蛋白浓度和血凝滴度均最高(图2A、2B、2C)。这也是M区带所在位置，该区带蛋白质量浓度最高可达1.2 mg/mL，血凝滴度为1×49。另外，病毒层在波长为215 nm处的吸光度较260 nm和280 nm处有更显著的峰。第16层(H区带)的血凝滴度也为1×49，但吸光度和蛋白浓度均较14层主峰低。正常鸡胚尿囊液也以同样纯化方法处理，但未见蛋白区带出现(图1～4)。

图1 分层分析蔗糖密度梯度离心纯化的流感病毒Fig.1 Analysis of fractions of the purified influenza virus by sucrose density gradient

图2 密度梯度纯化后分布收集并分层检测Fig.2 The production of sucrose density gradient centrifugation was collected and separated into fractions for test

2.2 病毒颗粒的形态学观察 用透射电镜分别观察L、M、H区带发现(图3)，L区带为具有血凝活性的质膜和结构疏松的病毒组成(图3A)。M区带病毒颗粒大部分呈球形结构，直径在50～100 nm，同时有大量空心病毒颗粒存在(图3B)。另外，也有长度在200～400 nm的丝状或棒状病毒颗粒(图3C)。病毒外层可见到清晰的血凝素或神经氨酸酶蛋白棘突(图3D)。H区带与M区带观察结果类似，但未发现空心病毒颗粒。

图3 流感病毒的电镜观察Fig.3 Photographs of viral particles revealed by transmission electron microscopy

2.3 病毒颗粒免疫原性评价 免疫小鼠血清经血凝抑制试验检测，高剂量组血凝抑制效价为6 654.0±1.5，低剂量组为630.3±2.8，PBS对照组为26.0±1.5。3组血凝抑制效价间的差异有统计学意义(F=48.44，P<0.01)。3组间两两比较显示，高剂量组和低剂量组血凝抑制效价均较对照组高(P<0.001)，其中高剂量组高于低剂量组(P<0.001)。

3 讨 论

目前在流感病毒纯化方面，由于层析技术的迅速发展，现在大多利用该技术制备流感病毒[5]，其中BLOM等[6]建立了流感病毒凝胶色谱纯化法，KALBFUSS等[7]先利用凝胶色谱柱粗纯然后用离子交换色谱法进一步纯化而获得病毒颗粒。也有报道用中空纤维柱超滤结合分子筛色谱法纯化流感病毒[8]。而很少使用传统的密度梯度超速离心技术制备流感病毒颗粒，以往也有对传统密度梯度离心方法与层析方法的比较研究，层析法的病毒蛋白纯度略高密度梯度离心法，但是蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率更优于层析法[9]。与此同时，在流感病毒抗原制备中，利用基因工程技术重组表达流感病毒蛋白[10-12]，尤其是用于高致病性禽流感蛋白表达[13-14]，这也为亚单位疫苗的开发提供了基础。而此研究利用蔗糖密度梯度离心技术大量制备完整流感病毒颗粒，并分析病毒的免疫原性。

密度梯度离心纯化病毒方法简单，操作易于掌握，并可获得完整病毒颗粒，病毒区带较为明显利于回收。因此，本研究通过蔗糖密度梯度纯化流感病毒颗粒，分布收集后发现，M区带为主要病毒层，浮密度为1.181 4，与早期利用密度梯度离心法制备流感病毒结果相同[15]，病毒纯化过程中不影响病毒血凝活性。前期也利用氯化铯作为密度梯度离心介质纯化流感病毒，但由于氯化铯高盐成分对血凝活性有较大影响而此次纯化未被采用。病毒颗粒在波长为215 nm处较为敏感，所以不管采用层析技术还是密度梯度离心技术均可用215 nm波长监测病毒峰。完整的病毒颗粒大小不均匀，有球形、丝状和棒状等，并在M区带存在空心病毒颗粒。在病毒纯化技术优化中发现，用超离浓缩病毒时会产生许多不规则型病毒颗粒，而用超滤或切向流过滤浓缩可保持病毒颗粒呈圆形或椭圆形形状，这与SUGITA等[16]的报道相似，但是超滤和切向流浓缩较超离浓缩耗时长、病毒易结合到滤膜上降低回收率、操作复杂等。因此，在病毒形态学研究中尽量用超滤或切向流浓缩病毒，如果仅需要制备病毒抗原可选择超离快速浓缩或在浓缩前对病毒进行固定也可行超离浓缩并保持病毒正常形态。另外，L区带在电镜下观察到与病毒连接的质膜结构，同时具有血凝活性，推断是病毒分泌出细胞时携带的宿主细胞膜结构[17-18]。此次纯化产物分层收集后也进行了SDS-PAGE分析，大于72 ku的杂蛋白被低密度蔗糖阻留在1～10层，病毒蛋白主要在13～15层(图4)。利用14层病毒抗原免疫小鼠后，与空白对照组相比，病毒抗原可以刺激小鼠产生具有很高血凝抑制活性的抗体。这也表明，通过该方法纯化病毒时不会影响病毒的免疫原性。

图4 密度梯度离心分层收集纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.4 The production of sucrose density gradient centrifugation separated into fractions for SDS-PAGE

综上，虽然现在科技不断进步，层析技术日新月异，但是在病毒纯化中，密度梯度离心法也具有其用武之地和独到之处，由于超离是通过物理方法分离病毒，所以操作过程中不会添加其他化学试剂，对病毒活性影响较小。密度梯度离心条件优化时发现，离心2 h后病毒层位置偏上且较疏松，4～6 h后病毒颗粒形成清晰致密病毒层，回收蛋白浓度高，而层析时洗脱体积较大，病毒蛋白浓度低且层析填料对病毒损耗较大导致回收率下降。如果适量延长超离时间，使病毒达到其等密度梯度，也可进一步分离空心病毒与完整病毒，层析无法对这两种病毒进行分离。如果病毒含量低时可在梯度液上层加入结晶紫，在离心过程中病毒颗粒被染成蓝色形成蓝色致密病毒层，利于回收。本研究对蔗糖密度梯度纯化流感病毒做了优化和评价，并鉴定了病毒颗粒的免疫原性，为下一步天然病毒血凝素提纯提供原材料，为流感疫苗开发奠定了基础。

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(编辑 韩维栋)

Purification and biological characterization of influenza virus type A

LIU Yang1,2, ZHAO Xiang-rong1,2, GUO Chun-yan1,2, HU Jun1,2, YU Peng-bo3

(1. Central Laboratory of Shaanxi Province People’s Hospital, Xi’an 710068;2. the Third Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710068;3. Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, Xi’an 710054, China)

Objective To evaluate the purification method of sucrose density gradient for influenza A virus and analyze the characterization and immunogenicity of influenza A virus. Methods Influenza virus was produced with allantoic fluid from fertilized eggs. Harvested allantoic fluid was concentrated by ultracentrifugation and the viral particles were purified utilizing sucrose density gradient ultracentrifugation. The purification of viral particles was analyzed by hemagglutination test, micro-BCA protein assay, transmission electron microscopy and SDS-PAGE. The mice were immunized with the purification of inactivated virus. The serum of the titer of hemagglutination inhibition was determined by hemagglutination inhibition test. Results Influenza viral particles were successfully purified utilizing sucrose gradient ultracentrifugation. The virus was found to be separated into three zones (zones L, M and H). The optional density, protein concentration and HA titer of M zone were the highest. The protein concentration and HA titer were 1.2 mg/mL and 1×49, respectively. TEM revealed that zone L contained viral particles and plasma membrane with HA activity. Viral particles of zone M were spherical or extended threadlike, with some hollow viral particles. H and M were the same; however, hollow viral particles were not found in zone H. The high HAI activity antibody responses were induced by the purified virus in mouse immunogenicity studies. Conclusion Sucrose density gradient ultracentrifugation is an effective method for preparation of influenza virus, which can ensure the immunogenicity of the virus. Therefore, the method of density gradient ultracentrifugation can provide technical support for viral fundamental study and the development of influenza vaccine.

influenza virus type A; sucrose density gradient ultracentrifugation; immunogenicity

2015-11-17

2016-04-25

国家科技重大专项传染病监测技术平台项目(No.2013ZX10004202)；国家科技重大专项(No.2014ZX10004002-002-005)

Supported by the National Major Project of Infectious Diseases of Science and Technology Monitoring Platform (No.2013ZX10004202) and National Major Projects (No.2014ZX10004002-002-005)

胡军. E-mail: hjj6562@163.com；余鹏博. E-mail: sxcdcy@126.com

R373.1+3

A

10.7652/jdyxb201606025

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161012.0948.004.html(2016-10-12)