18β-甘草次酸哌嗪衍生物抗肝癌SMMC-7721细胞活性研究

郝秀静，阳 辉，王 娟，李 敏，李学强

(1. 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川 750021；2. 宁夏大学，宁夏银川 750021)



◇基础研究◇

18β-甘草次酸哌嗪衍生物抗肝癌SMMC-7721细胞活性研究

郝秀静1,2，阳 辉2，王 娟1,2，李 敏1,2，李学强2

(1. 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川 750021；2. 宁夏大学，宁夏银川 750021)

目的 研究18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35对SMMC-7721细胞增殖的的抑制作用及对凋亡的影响。方法 用18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35以不同浓度、不同时间段处理SMMC-7721细胞，显微镜下观察其对肝癌SMMC-7721细胞形态结构的影响；MTT法检测18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35对SMMC-7721细胞的增殖抑制率；Hoechst-33258细胞凋亡染色试剂盒检测细胞凋亡情况；Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果 MTT检测结果表明，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35能够抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，且呈浓度依赖性(P<0.05)；流式细胞仪检测细胞凋亡率，D35为26.71%、D34为36.95%。结论 18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35对SMMC-7721细胞有增殖抑制作用和促凋亡作用，且优于18β-甘草次酸(GA)。

18β-甘草次酸；哌嗪衍生物；SMMC-7721；细胞凋亡

甘草(glycyrrhiza)是一味重要的传统中药，其主要的活性成分是甘草次酸[1-2]。研究表明，甘草次酸不仅具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗病毒、免疫调节等功效[3-6]，还能抑制一些肿瘤细胞的生长[7-8]。但是由于甘草次酸几乎不溶于水以及高浓度时对正常细胞的毒性作用，制约了其在临床上的应用[9]。研究表明，甘草次酸通过某些改造和修饰后，其生物活性明显提高[10-11]。哌嗪基团是一个增效基团，能有效地调节药物的脂水分配系数和酸碱平衡常数，在很多的活性药物分子中都含有这一骨架结构，显示出广泛的生物活性，如抗微生物、抗高血压、抗癌、消炎和止痛等[12-14]。本研究将宁夏大学化工学院制备的18β-甘草次酸-哌嗪化合物D34、D35作用于SMMC-7721细胞，检测其对细胞增殖的抑制作用，为获取新药成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 18β-甘草次酸(GA，规格：97%，Sigma)，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35(由本校化工学院提供，简称D34、D35)；MTT(凯基)；RPMI 1640培养基(GIBCO)；胎牛血清(HyClone)；DMSO(Sigma)；PBS(Solarbio)；Hoechst-33258细胞凋亡染色试剂盒(碧云天)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(BD)。

1.2 主要仪器 微量移液器(Thermo)；酶标仪(BIO-RAD)；荧光显微镜(LEICA，DM2500)；生物显微镜(OLYMPUS)；流式细胞仪(BD FACSCalibur)；培养箱(上海一恒)。

1.3 细胞株SMMC-7721 细胞株取自宁夏大学西部特色资源保护与利用教育部重点实验室保存的种质库中。

1.4 方法

1.4.1 18β-甘草次酸哌嗪衍生物的合成路线 18β-甘草次酸与哌嗪基团进行酰胺化反应得到18β-甘草次酸-哌嗪化合物(图1)。D34、D35为其中的两种化合物。

图1 18β-甘草次酸哌嗪衍生物的合成路线Fig.1 The method of synthesizing 18β-GA derivatives containing piperazine

1.4.2 SMMC-7721细胞的培养 培养基：RPMI 1640培养基(含有100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)；培养条件：50 mL/L的CO2的培养箱中37 ℃培养。

1.4.3 镜检法观察18β-甘草次酸衍生物对肝癌SMMC-7721细胞形态结构的影响 先将D34、D35、GA用DMSO配制成质量浓度为5 mg/mL的贮备液，临用前用培养液稀释成浓度梯度为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL，备用。取对数生长期细胞，以3×103个/孔接种于96孔板，每孔100 μL。24 h后去上清，加入已经配置好的待测药物，每孔100 μL。设空白对照并且每个药物浓度设置5个平行孔，继续培养，在24、48、72 h三个时段用倒置荧光显微镜观察细胞形态结构的变化。

1.4.4 MTT法检测D34、D35对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用 取对数生长期细胞，以3×103个/孔接种于96孔板，每孔100 μL。24 h后去上清，加入已经配置好的待测药物，每孔100 μL。设空白对照并且每个药物浓度设置5个平行孔，MTT法检测药物对细胞的增殖抑制作用。按下述公式计算抑制率：

1.4.5 Hoechst染色观察 取经D34、D35、GA(终质量浓度50 μg/mL)作用72 h后的细胞，根据细胞凋亡Hoechst-33258染色试剂盒提供的操作步骤处理后，用荧光显微镜观察细胞形态的变化。

1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔1×106个细胞,培养12 h。实验组分别加入终质量浓度均为50 μg/mL药物GA、D35、D34，对照组加入等量培养液。48 h后，收集细胞，按BD公司的Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡的试剂盒步骤处理，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结 果

2.1 18β-甘草次酸衍生物对肝癌SMMC-7721细胞形态结构的影响 在显微镜下，未经药物处理的细胞增殖很快，细胞贴壁生长良好，未出现膨胀和皱缩现象；但实验组随着药物浓度的增加以及作用时间的延长，细胞出现皱缩、裂解、甚至碎片化。提示18β-甘草次酸及其衍生物对肝癌细胞的细胞形态有明显影响，抑制了细胞的生长(图2)。

图2 GA、D35、D34(50 μg/mL) 作用不同时间段对SMMC-7721细胞形态的影响Fig.2 Effects of GA, D35, D34 (50 μg/mL) on the morphology of SMMC-7721cells at different time points (×200)

2.2 D34、D35、GA对细胞增殖的抑制作用 MTT法结果显示，不同浓度的GA、D35、D34对SMMC-7721细胞增殖均有抑制作用，呈浓度依赖性，且D35、D34对SMMC-7721细胞增殖抑制率高于GA。经单因素ANOVA分析，D34、D35各组抑制率与对照组GA相比除个别数据外差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.3 Hoechst-33258荧光染色显示药物对细胞形态结构影响 收集经GA、D35、D34(终质量浓度均为50 μg/mL)处理72 h后的细胞，按细胞凋亡Hoechst-33258染色试剂盒步骤操作，用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示，对照组细胞形态结构完整，经染色呈现正常的均匀的蓝色，只有个别细胞破碎，呈现亮蓝色；实验组细胞结构变形，呈现碎片状，荧光颜色呈现亮蓝色(图3)。提示D34、D35对肝癌细胞有诱导其凋亡的作用。

图3 Hoechst 染色SMMC-7721细胞的凋亡情况Fig.3 Apoptosis of Hoechst staining of SMMC-7721 cells (72 h, ×400)

表1 不同浓度D34、D35、GA对SMMC-7721人肝癌细胞的抑制率Tab.1 The inhibition rate of D34, D35 and GA on SMMC-7721 cells

2.4 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率的比较 收集经GA、D34、D35(终质量浓度均为50 μg/mL)作用48 h的细胞，对照组为加入与实验组等量的培养液的细胞，按BD公司Annexin V-FITC/PI双染的检测凋亡的试剂盒步骤处理，上流式细胞仪检测细胞凋亡率(FL1为FITC荧光通道，FL2为PI荧光通道)。结果显示，GA作用细胞后的凋亡率为23.95%、D35为26.71%、D34为36.95%，均高于未加药处理组(4.23%)，且D35、D34的流式检测凋亡率高于GA组(图4)。

图4 SMMC-7721细胞流式凋亡图(48 h, 50 μg/mL)Fig.4 Apoptosis of SMMC-7721cells detected by flow cytometry (48 h, 50 μg/mL)

3 讨 论

甘草次酸及其衍生物具有广泛的药理活性，特别是在抗肿瘤方面。越来越多的研究表明，18β-甘草次酸对多种癌细胞，如HepG2肝癌细胞、胃癌细胞等表现出比较强的生物活性[15]。高振北等[16]对18β-甘草次酸A环进行改造，其体外抗肿瘤活性与GA比明显增强。文献也报道了对甘草次酸进行其他化学修饰和结构改造后活性的变化，其抗炎、抗肿瘤、抗病毒等活性均得到提高[10-11]。

哌嗪基团是一个增效基团，在很多的活性药物分子中都含有这一骨架结构，一些药物天然结构中增加这一活性基团后，生物活性明显提高。李学强等[13]在青蒿素上嫁接哌嗪基团后，对肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制率明显增强。本实验将18β-甘草次酸与哌嗪进行酰胺化反应得到了18β-甘草次酸-哌嗪化合物，经初筛后选取其中的D34、D35作用于SMMC-7721肝癌细胞，寻求提高药用效果、降低其毒副作用的新药成分。

本研究结果表明，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35等对SMMC-7721细胞均有抑制作用且优于18β-甘草次酸，特别是D34在低浓度下作用48 h后对肝癌细胞增殖抑制率达到了53%；从流式细胞凋亡数据可知，D35、D34均可诱导SMMC-7721肝癌细胞的凋亡，都优于18β-甘草次酸，且D34的促凋亡比例更高 。提示，18β-甘草次酸经过结构改造增加哌嗪基团以后，其生物活性明显提高。本研究为筛选出高活性的甘草次酸衍生物类药物奠定了实验基础。而关于18β-甘草次酸哌嗪衍生物对SMMC-7721细胞的促凋亡的作用机制以及是否对正常细胞有毒性等有待下一步的研究。

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(编辑 卓选鹏)

Effects of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine on SMMC-7721 cell activity

HAO Xiu-jing1,2, YANG Hui2, WANG Juan1,2, LI Min1,2, LI Xue-qiang2

(1. Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Ningxia 750021; 2. Ningxia University, Ningxia 750021, China)

Objective To study the effects of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721cells. Methods The morphology of the cells treated with 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 was observed under the microscope. The cellular inhibition rate was detected by MTT; apoptosis was detected by Hoechst-33258 Staining Kit; and apoptosis rate was analyzed by flow cytometry method. Results The proliferation of SMMC-7721 cells was significantly inhibited by 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells, and they are superior to GA.

18β-glycyrrhetinic acid; piperazine derivative; SMMC-7721; apoptosis

2015-12-01

2016-05-23

国家自然科学基金资助项目(No.21062014)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21062014)

郝秀静. E-mail: shuaxinxianlu@163.com

R966

A

10.7652/jdyxb201606005

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1656.008.html(2016-10-10)