Delta样配体4和基质金属蛋白酶2、白细胞分化抗原34在结直肠癌组织中的表达水平及相关性

王宏磊，赵永捷，王　玉，高　浩，唐　涛，张明庆，吕宏程

Delta样配体4和基质金属蛋白酶2、白细胞分化抗原34在结直肠癌组织中的表达水平及相关性

王宏磊1，赵永捷1，王玉1，高浩2，唐涛3，张明庆2，吕宏程3

目的：探讨Delta样配体4（DLL4）和基质金属蛋白酶2(MMP-2)、白细胞分化抗原34(CD34)在结直肠癌组织中的表达及其之间的相关性。方法：应用免疫组化方法检测90例临床确诊为结直肠癌组织中DLL4及MMP-2、CD34的表达情况并分析其与结直肠癌临床病理特征的相关性。结果：通过免疫组化可以发现，DLL4（均值为4.91）和MMP-2（均值为5.34）、CD34（均值为5.40）在癌组织中的表达水平较癌旁组织、正常组织中的表达均明显增高；DLL4和MMP-2、CD34在癌旁组织中的表达水平较正常组织中也明显增高。DLL4表达水平与病理分期T、N分期相关，呈正相关（相关系数分别为0.226、0.262），但与MMP-2、CD34的表达水平并无相关性。结论：在结直肠癌组织中，DLL4的表达水平明显增高，与肿瘤侵润程度、淋巴结转移情况相关。

Delta样配体4；基质金属蛋白酶2；白细胞分化抗原34；结直肠癌

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，近年来我国结直肠癌发病率和病死率迅速增长且发病年龄明显提前，中位发病年龄为58岁，比西方国家要早12～18年。对于结直肠癌，传统治疗以外科手术为主、放化疗辅助。但很多患者在就诊时已丧失手术机会，且部分患者对于现有化疗药物敏感性差，这就迫使我们进一步寻找新的药物作用靶点。

在已经发现的肿瘤分子信号通路中，Notch信号通路可与促使肿瘤发生发展相关的其他关键性通路相互作用，调节包括结直肠癌在内的多种肿瘤细胞的增殖与进展。Notch途径的受体Notch1在结直肠癌中的高表达是其独立的预后影响因素[1]。Notch配体Delta样配体4（delta like ligand-4,DLL4）是5个配体中唯一特异性存在于内皮细胞的配体，在正常机体及肿瘤血管形成的过程中发挥着重要功能，而且在这个过程中，有许多分子参与其中，如基质金属蛋白酶2(matrix metalloid proteinase-2,MMP2)、及白细胞分化抗原34(cluster of differentiation 34,CD34)[2]。

本文研究中选择的DLL4[3-4]、MMP2、CD34等都是与肿瘤新生血管密切相关的分子[5-6]，对寻找新的抗癌药物靶点和提示病情有重要的指导意义。但在结直肠癌组织中的DLL4、MMP-2、CD34表达水平及其之间相关性的研究目前鲜有报道，本文将就此进行研究，并探讨其之间的表达相关性。

1　资料与方法

1.1结直肠癌标本组织芯片制备收集90例天津市人民医院2010年1—2010年9月经手术病理证实的结直肠癌组织蜡块，其中男性47例，女性43例；平均年龄68岁（24～90岁）。所有患者均未进行新辅助治疗。所有患者接受R0切除手术，检获淋巴结数目均大于15枚。根据HE切片对石蜡标本中有代表性的点进行标记，包括典型的肿瘤和邻近的正常组织。制备受体蜡块，在组织芯片制作机上用细针对受体蜡块打孔，同样在供体蜡块上标记的相应部位打孔采集组织芯。将组织芯转移到受体模块的孔中。将构建好的TMA芯片蜡块放在相宜的塑料盒子内，并严密固定防止移位。放入55℃温箱中约10 min，在蜡将要完全溶解前，取出室温下冷却，使受体模块的蜡与新插入的小圆柱状组织溶为一体，取下蜡块，于4℃冰箱中保存备用。切片、烤片，-20℃保存备用。

1.2DLL4及MMP-2、CD34免疫组化染色将组织芯片进行逐步脱蜡和水化，并进行抗原修复：电炉加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10～15 min。采用免疫组化染色SP法：滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体；滴加Ι抗50 μL，室温静置1 h或4℃过夜或37℃1 h；PBS洗3次每次2 min；滴加Ⅱ抗45-50 μL，室温静置或37℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB显色5～10 min；PBS或自来水冲洗10 min；苏木精复染2 min，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15 min；脱水、透明、封片、镜检。

1.3病理阅片及免疫组化结果判定由两位病理科医师在不知临床病理学资料的情况下对免疫组化的结果进行评估。在高倍镜(×200)下，随机取5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，按阳性细胞数的平均百分数进行计分。0.0%～5.0%记0分，5.1%～ 25.0%记1分，25.1%～50.0%记2分，50.1%～75.0%记3分，＞75.0%记4分。染色强度按多数阳性细胞呈现的染色特征计分。未着色记0分，染色呈淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。最后根据阳性细胞的百分比和染色强度计分之和进行结果判定。

1.4统计学分析采用SPSS 19.0软件进行数据处理，组间比较采用LSD-T检验，两者相关性用非参数Spearman等级相关分析。以P＜0.05作为差异具有统计学显著性意义的界值。

2　结果

2.1DLL4及MMP-2、CD34在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达情况DLL4在癌组织中的表达水平较癌旁组织、正常组织均明显增高(P＜0.05)，DLL4在癌旁组织中的表达水平较正常组织也明显增高(P＜0.05)；MMP-2在癌组织中的表达水平较癌旁组织、正常组织中的表达均明显增高(P＜0.05)，MMP-2在癌旁组织中的表达水平较正常组织也明显增高(P＜0.05)；CD34在癌组织中的表达水平较癌旁组织、正常组织中的表达均明显增高(P＜0.05)，CD34在癌旁组织中的表达水平较正常组织也明显增高(P＜0.05)（如表1）。以上差异均有统计学意义。

表1　DLL4、MMP-2、CD34在肿瘤组织、癌旁组织、正常组织中的表达情况（得分，±s）

表1　DLL4、MMP-2、CD34在肿瘤组织、癌旁组织、正常组织中的表达情况（得分，±s）

DLL4 MMP-2 CD34癌组织4.91±1.36 5.34±0.96 5.40±0.93癌旁组织4.43±1.03 4.67±1.12 4.46±1.00正常组织3.14±0.91 3.09±0.75 3.41±1.01

2.2DLL4与MMP-2、CD34在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达相关性DLL4与MMP-2在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达无相关性；DLL4与CD34在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达无相关性；MMP-2与CD34在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达无相关性，见表2。

2.3DLL4、MMP-2、CD34在癌组织中的表达水平与临床参数之间的相关性DLL-4表达与病理分期T分期、N分期相关，呈正相关，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表达水平越高。与其余临床、病理参数并不相关。见表3。

3　讨论

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，严重危害人们的健康生活，很多患者就诊时已丧失手术机会。化疗虽可有效控制肿瘤的发展，但有部分患者对于现有化疗药物敏感性差，这就迫使我们进一步寻找新的药物作用靶点。

表2　DLL4、MMP-2、CD34在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达相关性

表3　DLL4、MMP-2、CD34的表达水平与临床、病理参数之间的相关性

Notch信号同路是目前我们发现的结直肠癌信号传导同路中的一个重要通路，该通路在内皮细胞的发育分化、干细胞分化、血管形成及肿瘤发生发展过程中具有重要作用。Notch途径的受体Notch1在结直肠癌中的高表达是其独立的预后影响因素[1]。Notch配体DLL4是5个配体中唯一特异性存在于内皮细胞的配体，目前多项研究发现DLL4的表达与肿瘤血管生成密切相关。体外实验中，不同研究者通过改变DLL4的状态观察其对血管生成及肿瘤生长的作用，Noguera-Troise等[7]将DLL4的表达的肿瘤细胞移植到小鼠体内，肿瘤血管内皮增生、血管密度增加。Ridgway等[8]研究也显示抑制DLL4的表达可减少人类纤维肉瘤细胞系或白血病细胞系的小鼠肿瘤的生长。Stewart等[9]还发现，阻断DLL4的表达会导致血管周细胞/血管平滑肌细胞的数量减少、血管开放、管腔减少及血管功能下降，进而抑制肿瘤生长。而肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，包括毛细血管基底膜降解、血管内皮细胞迁移增殖、形成管状结构、基底膜形成、血流贯通等步骤[10]。这一过程既受机体神经内分泌因素等影响，又受肿瘤细胞和肿瘤基质细胞表达的生长因子调控。DLL4对于肿瘤血管生成的调控可能与其他因素互相影响，共同作用。一项针对脐静脉内皮细胞的研究显示，Notch途径参与了VEGF介导的MMPs的激活，且MMPs抑制剂能够阻断Notch活化导致的血管内皮细胞的形态变化[11]。目前研究已证实基质金属蛋白酶（MMPs）在肿瘤的血管生成中发挥重要的作用。其中MMP-2是参与血管形成的主要成员。此外，MMPs能够降解细胞外基质，MMP-2是MMPs中破坏基质降解平衡，促进肿瘤浸润和转移的主要因子[12]。在肿瘤血管生成及浸润转移的过程中，可能同样存在Notch途径与MMPs表达之间的互相影响，共同参与肿瘤血管生成及浸润转移。而且已有研究[13-15]表明DLL4的表达情况与乳腺癌、胆管癌、胰腺癌的预后都有密切关系，且在乳腺癌中DLL4的表达与MMP2相关[16-17]。但是，结直肠癌肿瘤组织中的DLL4、MMP-2、CD34表达水平及其之间相关性的研究目前鲜有报道。

本文研究发现DLL4和MMP-2、CD34在癌组织中的表达水平均较癌旁组织、正常组织中明显增高，且癌旁组织中的表达也较正常组织明显增高。但DLL4与MMP-2、DLL4与CD34、MMP-2与CD34在癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达并无明显相关性。DLL4是VEGF信号通路的下游信号分子，也是肿瘤血管新生的条件，而MMP-2是肿瘤生长和浸润必须的酶，同时CD34是血管内皮的标记物，理论上三者应该有密切的关联性。但我们研究中发现三者之间并无明显相关性。这可能是由于肿瘤生长是VEGF-Notch/DLL4信号通路和其他促进肿瘤生长的因素共同作用的结果，有其他因素干预或者调节这条信号同路。

我们同时对DLL4、MMP-2、CD34的在结直肠癌组织表达水平与临床参数之间的相关性进行了分析，发现DLL4的表达DLL-4表达与病理分期T分期、N分期相关，呈正相关，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表达水平越高。这提示我们DLL4在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平可能与肿瘤侵润程度及淋巴结转移相关，可能对患者的预后产生影响，但仍需进一步的随访调查来探究。

综上，DLL4、MMP-2、CD34在癌组织中的表达水平较癌旁组织、正常组织中均明显增高，且DLL4的表达水平与病理分期T分期、N分期呈正相关。但是，DLL4与MMP-2、CD34的表达水平与临床预后之间的关系目前仍不清楚，仍需进一步的随访调查来探究。这也是我们下一步的研究方向。

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（收稿：2016-02-06修回：2016-04-26）

（责任编辑李 勇屈振亮）

The Expression of Delta Like Ligand-4,Matrix Metalloid Proteinase-2 and Cluster of Differentiation 34 in Colorectal Cancer Tissues and its Correlation with clinicopathologic Feature

WANG Hong-lei, ZHAO Yong-jie,WANG Yu,et al.Department of General Surgery,Tianjin Union Medical Center,Tianjin (300121)，China

ObjectiveTo investigate the expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in colorectal cancer tissues and its correction with clinicopathologic feature.MethodsImmunohistochemical methods were used to detect the expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in 90 cases of clinically diagnosed colorectal cancer tissues and investigate their correlation with clinicopathologic feature.ResultsThe expression level of DLL4 (average 4.91),MMP-2(average 5.34)and CD34(average 5.40)in tumor tissues were significantly higher than in adjacent tissues and normal tissues.Expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in adjacent tissues was sig⁃nificantly higher than those in normal tissues.The expression level of DLL4 was positively corrected with patho⁃logical stage of T and N.(correlation index 0.226,0.262),but it was not related with the expression level of MMP-2 and CD34.ConclusionIn colorectal cancer tissues,the expression level of DLL4 was significantly increased and correlated with extent of tumor invasion and lymph node metastasis.

Delta like ligand-4；matrix metalloid proteinase-2；cluster of differentiation 34；colorectal can⁃cers

R735.3+5

A

1007-6948(2016)03-0211-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.001

天津市卫生与计划生育委员会重点项目(2012KR13)

天津市人民医院1.普外科;2.肛肠外科;3.病理科（天津 300121）

赵永捷，E-mail:zhaoyongjie@umc.net.cn