薄荷复方煎液对致龋菌生长代谢的体外研究

丘创华，李卓成△，孙 墅

(深圳市第二人民医院：1.检验科 2.口腔科，广东深圳 518000)



·论 著·

薄荷复方煎液对致龋菌生长代谢的体外研究

丘创华1，李卓成1△，孙 墅2

(深圳市第二人民医院：1.检验科 2.口腔科，广东深圳 518000)

目的 研究薄荷复方煎液对致龋菌生长及产酸的影响，明确薄荷复方煎液的抗菌机制。方法 选择变形链球菌、血链球菌和牙龈卟啉单胞菌作为实验菌株，用纸片扩散法测定薄荷复方煎液对菌株的抑制作用，同时测量不同质量浓度薄荷复方煎液对菌株产酸的影响。结果 薄荷复方煎液能有效抑制血链球菌和牙龈卟啉单胞菌的生长，同时有效抑制各实验菌株的产酸能力，只是在药物质量浓度上有一定差异。结论 薄荷复方煎液对致龋菌的生长和酸代谢具有一定的抑制作用。

龋齿/微生物学； 培养基; 薄荷复方煎液； 产酸； 抑制

现代龋病学认为，龋齿在本质上是口腔菌群生态失衡性疾病。抗菌药物的使用、免疫防龋和氟化物防龋等方法虽具有一定的防龋效果，但仍有诸多局限性。本研究选用一些具调理菌群生长和代谢作用的天然药物包括薄荷、仙灵脾、露蜂房等中药，研究其对致龋菌生长和产酸的影响，为今后筛选能有效调理口腔菌群生态平衡的药物提供参考，从而可以制作出更加对症的、精确的防治药物。

1 材料与方法

1.1 配制薄荷复方煎液 组方：薄荷15 g，食盐(炒，后下)10 g，川椒10 g，仙灵脾10 g，补骨脂15 g，细辛5 g，白芷10 g，石菖蒲10 g，蚤休20 g，露蜂房10 g。加水1 000 mL，文火煎3 h至约100 mL过滤、离心3次，制成原液。

1.2 选择致病菌 购买美国变形链球菌ATCC25175、血链球菌ATCC10556、牙龈卟啉单胞菌ATCC33277各1支。

1.3 制备药物纸片 选择新华1号中性定性滤纸，用打孔器打成直径6 mm圆片，将制作好的滤纸分装到小西林瓶里，用牛皮纸封瓶口进行高压(121 ℃、15 min)烘干后分别加入薄荷复方煎液、0.05%氯己定溶液(阳性对照)和0.9%生理盐水各1 mL，置于冰箱内过饱和液体浸泡过夜，取出纸片再置于冷冻真空干燥机内抽干，4 ℃密封保存。

1.4 纸片扩散抑菌法 将变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉单胞菌分别接种于脑心浸液肉汤(BHI)培养基中，在80%氮气(N2)、20%二氧化碳(CO2)、37 ℃条件下厌氧培养24 h，用BHI将菌悬液浓度调至1.0 McFarland(3×108CFU/mL)备用。将配制好的变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉单胞菌100 μL分别滴入3个牛BHI固体培养基，用三角形波棒推匀后在琼脂表面放置上述浸药滤纸片，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。每平皿放置各纸片1片，每次4个平行平皿，80%N2、20%CO2、37 ℃下厌氧培养48 h，用卡尺测量抑菌圈直径，实验共重复3次，结果取平均值。

1.5 薄荷复方煎液对口腔致龋细菌产酸水平的影响 将薄荷复方煎液按倍比稀释法制成0.125、0.250、0.500、1.000 g/mL，消毒后备用。利用1 mol/L的NaOH将BHI液体培养基调定初始pH值为7.4。取消毒试管5支，每支试管中加入BHI液体培养基(pH 7.4)4 mL，3×108CFU/mL变形链球菌的菌悬液0.2 mL，在1～4号试管中分别加入0.125、0.250、0.500、1.000 g/mL薄荷复方煎液0.2 mL，5号试管中不加药液作为对照组。同理测定薄荷复方煎液对血链球菌、牙龈卟啉单胞菌产酸水平的影响。

2 结 果

2.1 薄荷复方煎液对3种致龋细菌的抑菌效果 薄荷复方煎液对血链球菌、牙龈卟啉单胞菌的抑菌圈直径与0.05%氯己定组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对变形链球菌抑菌效果较差，与0.05%氯己定比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 薄荷复方煎液对3种致龋细菌的抑菌效果比较

*：P<0.05，与0.05%氯己定比较。

2.2 薄荷复方煎液对3种致龋细菌产酸的抑制作用 薄荷复方煎液不同质量浓度对3种致龋细菌产酸具有不同程度的抑制作用。血链球菌和牙龈卟啉单胞菌产酸随薄荷复方煎液质量浓度增加而减少，各质量浓度组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。0.500、1.000g/mL薄荷复方煎液对变形链球菌产酸的抑制作用与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，0.125、0.250g/mL薄荷复方煎液对变形链球菌产酸的抑制作用与对照组比较并未发生明显改变，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 薄荷复方煎液对3种致龋细菌产酸的抑制作用

*：P<0.05，与对照组比较。

3 讨 论

龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病，其中变形链球菌、粘性放线菌、乳杆菌、血链球菌是最主要的病原菌[1]。牙周病是一种常见的多发的感染性破坏性口腔疾病，是发生在牙齿支持组织的疾病包括牙周软、硬组织炎性紊乱与破坏，牙周病证据最充分的致病菌是伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌。因此本研究选择变形链球菌、血链球菌和牙龈卟啉单胞菌作为研究的细菌。

越来越多的研究表明，慢性牙周炎的危害已不仅局限于口腔，还与一些全身系统性疾病密切相关。牙周感染导致的菌血症和脓血症促进了全身免疫反应和炎性反应，从而影响系统性疾病的发生、发展。牙龈卟啉单胞菌还能通过降解低密度脂蛋白(LDL)中载脂蛋白(Apo)B-100，引起低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低，导致巨噬细胞吞噬增加，巨噬细胞吞噬大量胆固醇后转变为泡沫细胞，进而引起血脂升高，表明牙周感染可导致血脂异常[2]。牙周病患者总胆固醇(TC)和LDL水平升高表明牙周病可能会增加心血管疾病的发生风险[3]。

牙周病是多细菌感染性疾病，单一抗生素抗菌谱无法针对全部牙周病的致病菌。因此在牙周病的治疗中单纯采用甲硝唑无法收到理想疗效，阿莫西林、奥美拉唑与甲硝唑联合使用可有效扩大杀菌范围，能有效治疗敏感菌感染，取得较好的临床效果[4-6]。但单纯应用抗生素对于反复发作者容易产生耐药性，导致菌株和菌群比例失调。中医疗法强调标本兼治，可补充西医治疗注重局部清洁抗炎、根治效果不明显的缺陷，在常规治疗基础上结合中医辨证治疗，疗效显著优于单用西药治疗[7]。天然药物在龋病防治方面的研究备受关注，国外研究较多的天然防龋药物有可可、茶多酚、蜂胶等，国内研究较深入的有厚朴、五倍子、蜂房、茶多酚等。黄正蔚等[8]对儿茶、五倍子、蜂房等11种中药粗提物的抗菌活性、对细菌代谢产酸和合成胞外多糖能力的影响进行了研究，结果表明五倍子、蜂房、三七能全面抑制口腔细菌代谢酸的产生，五倍子、蜂房、血藤、川芎、大黄、儿茶和三七均能显著抑制变形链球菌胞外水不溶性多糖的生成。杨宁等[9]研究发现，中药野黄芩苷具有拮抗脂多糖(LPS)抑制人牙周膜细胞增殖的作用。曹寅等[10]配制了中药组方--降糖固齿汤，提取药液，采用二倍稀释法进行抑制牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌生长实验，发现中药原液能抑制牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌增长。姜迎春等[11]研究发现，银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌具有抑菌作用。

薄荷复方煎液配方是本院中医科专家通过多年临床经验总结得出的包括薄荷、川椒、细辛、补骨脂、仙灵脾、白芷、石菖蒲等10味中药，不但有杀菌消炎作用，而且能通过调节机体免疫力提高牙齿抗病能力，成本很低廉，充分利用了我国博大精深的中医理论和丰富的中药资源防治龋病、牙周病。本研究结果表明，薄荷复方煎液对血链球菌、牙龈卟啉单胞菌有较好的抑菌作用，其抑菌效果等效于0.05%氯己定；薄荷复方煎液对变形链球菌亦有一定的抑菌作用。

致龋菌通过无氧酵解代谢碳水化合物产生有机酸，在牙菌斑生物膜中使酸性代谢产物积聚，导致釉质脱矿，龋损发生。本研究结果显示，薄荷复方煎液在各个质量浓度梯度时对血链球菌、牙龈卟啉单胞菌的产酸均有显著抑制作用，对变形链球菌的产酸抑制作用较弱，只有0.500、1.000g/mL薄荷复方煎液对变形链球菌的产酸具有显著抑制作用。

本研究结果显示，薄荷复方煎液对血链球菌、变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌均有明显的抑制和杀灭作用，已达到满意的预期效果。但具体药物作用机制尚有待于进一步研究，后续通过动物实验和毒理实验及临床试用检验效果，最终制作出特效的防治龋病、牙周病的漱口水和局部治疗龋病、牙周病的药物。

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Effect of Menthol compound decoction on the growth and metabolism of cariogenic bacteria in vitro*

QiuChuanghua1，LiZhuocheng1△，SunShu2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofDentisty，ShenzhenSecondPeople′sHospital，Shenzhen,Guangdong518000,China)

Objective To investigate the effect of menthol compound decoction on the growth and acid metabolism of cariogenic bacteria and to find out the anticariogenic mechanism of Menthol compound decoction.Methods Streptococcus mutans,Streptococcus sanguinis and Porphyromonas gingivalis were chosen as the experimental bacteria.Firstly，slip diffusion method was used to examine the inhibitory effect of menthol compound decoction on cariogenic bacteria.Secondly，observing the effect of menthol compound decoction of different concentration on acid metabolism.Results Menthol compound decoction could inhibit the growth of Streptococcus sanguinis and Porphyromonas gingivalis.And it also inhibited the acid production of cariogenic bacteria，but the concentration of menthol compound decoction were different.Conclusion Menthol compound decoction may have an inhibitory effect on the growth and acid metabolism of cariogenic bacteria.

dental caries/microbiology； culture media； menthol compound decoction; acid metabolism; inhibitory

深圳市科技创新委员会资助项目(JCYJ20130401114747777)。 作者简介：丘创华，男，临床检验诊断学硕士，主要从事临床血液学的研究。△

E-mail：lizhuocheng@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.005

A

1673-4130(2016)02-0155-03

2015-09-02)