蜂胶与葡萄柚提取物混合液对变形链球菌作用的体外研究①

2016-05-11杨清岭项剑虹俎红伟

黑龙江医药科学 2016年2期

关键词：抑制葡萄柚产酸

杨清岭，项剑虹，俎红伟

(佳木斯大学附属第二医院儿童牙病科，黑龙江佳木斯154002)

蜂胶与葡萄柚提取物混合液对变形链球菌作用的体外研究①

杨清岭，项剑虹，俎红伟

(佳木斯大学附属第二医院儿童牙病科，黑龙江佳木斯154002)

摘要:目的:探讨葡萄柚提取物(GSE)、蜂胶这两种天然提取物配伍使用时在防龋方面的可行性，即期望通过两种天然提取物的配伍应用，达到降低单组分使用时的使用剂量和副作用。方法:采用液体稀释法。分别测定蜂胶、葡萄柚提取物以及两者混合溶液的MIC，进而通过分级抑制浓度指数，来判断混合液对变形链球菌生长作用的影响。结果:①通过分级抑制浓度指数计算表明，两药物联用对变形链球菌的抑制作用是相加作用。②混合药液对变形链球菌黏附抑制率取决于混合液浓度的变化呈正相关。③变形链球菌培养前后△pH值随着蜂胶与葡萄柚提取物混合液的浓度增加而显著降低。结论:将两药混合使用能降低各组分药物的使用浓度;两药物混合液在一定浓度范围能有效抑制变形链球菌对光滑玻璃表面的黏附;混合液可抑制变形链球菌产酸(［1］)。

关键词:蜂胶;葡萄柚;变形链球菌;抑制;黏附;产酸;正相关

GSE是一种天然提取物，是一种广谱抑菌类化合物，高效且很有发展潜力，杀菌在非常低的浓度时就可取得显著的效果。蜂胶具有毒副作用小［2］、抑菌效果好的特点。本研究进一步探究蜂胶和葡萄柚提取物配伍混合液的抗菌机制，为两者混合液能够应用于临床上防治龋病提供理论支持和实验依据。

1　资料与方法

1.1实验材料和试剂

(1)变形链球菌ATCC 25175:购于杭州百思生物［3］。(2)蜂胶(水溶性固体，纯度98%) :购于西安森卓生物科技。(3) TPY液体培养基(1.5%胰蛋白胨、1%葡萄糖、0.6% KH2PO4、0.4%酵母提取物、0.2% K2HPO4·3H2O、0.2% Na2CO3、0.2% NaCl，pH7.0) :青岛海天化玻。(4) TPY琼脂培养基(含1.25%琼脂的TPY液体培养基) :青岛海天化玻。(5)葡萄柚提取物:广州文玲贸易有限公司。(6)磷酸盐PBS缓冲液:实验室配置。(7)生理盐水等。(8)漱爽复方氯已定含漱液(含0.12%葡萄糖酸氯已定) :购于哈尔滨乐泰药液。

1.2药液的制备

(1) TPY液体培养基和固体培养基的配制:称取TPY液体培养基2.64g和4.64g，分别加入100mL蒸馏水。高压灭菌20min，备用。(2) PBS磷酸盐缓冲液的配制:称取磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 1.44，氯化钠(NaCl) 8g，氯化钾(KCl) 0.2g，吐温－20，加水。调pH 7.2，定容1L，备用。

1.3菌液的制备

将S.m接种于液体TPY培养基中，37℃厌氧培养24h，然后用离心机以3500r/min离心15min，弃上清液，PBS缓冲液冲洗菌液2次，加入装有无菌液体TPY培养基试管中，调节菌液浓度为D(630) = 1.0，用麦氏比浊法调整其浊度为至0.5麦氏浓度(细菌近似浓度为1.5×108个菌/mL)。

1.4药液制备、分组

蜂胶母液制备:取一定量的固体水溶性蜂胶放入无菌液体TPY中，配制成浓度为100mg/mL蜂胶母液，备用［4］。

实验组:用37℃预热的TPY液体培养基将蜂胶母液倍比配置成750.00000、375.00000、187.50000、93.75000、46.87500 mg / L共5个浓度组。阳性对照组:分别用37℃预热的TPY液体培养基和氯已定1mL充分混匀后，取出1mL混合物加入50 μL菌液。阴性对照组:加入菌液50μL和TPY液体培养基1mL。空白对照组:只含TPY液体培养基1mL。每组各浓度均设置5个重复管。

1.5测定葡萄柚提取物和蜂胶单组份各自的MIC值

用MTT比色法分别测定蜂胶、葡萄柚提取物各浓度组的OD值［5］，计算抑菌率。每组均加入100μL的1×108CFU/mL菌悬液，阳性对照组加入0.12%氯已定和菌液各100μL，阴性对照组TPY培养基和菌液各100μL，空白对照组只加200μLTPY培养基。用比浊法观察细菌生长情况，其中细菌不生长的最小浓度即为抑制变链菌生长的最小抑菌浓度。上述测定过程重复3次，取均值。

1.6确定蜂胶、葡萄柚提取物混合液的MIC值

通过MTT比色法测定蜂胶、葡萄柚提取物各浓度组混合液的OD值，在96孔板横排分别加入0.75000、0.37500、0.18750、0.09375、0.046875mg / mL蜂胶溶液100μL，纵排加入0.37500、0.18750、0.09375、0.04688、0.02344mg/mL葡萄柚提取物溶液100μL，将两溶液混合均匀，每孔分别加入已备好的菌液20μL。PBS洗涤后弃液，各孔再加入100μL 的TPY液体培养基和10μL MTT，然后加入150μL DMSO溶液，在摇床上振荡10min。测量出光密度值，计算出抑菌率达到80%时混合液的最小浓度，上述实验过程重复3次［6］。

1.7混合液抑菌效果的评估指标

依据上述实验测定结果，可计算出分级抑制浓度指数，进而判定两者的抗菌作用关系。

1.8葡萄柚－GSE对S.m黏附的影响

实验方法如下:取20个5mL玻璃试管，分成5组，每组四个试管平行对照［7］，加入制备好的TPY液体培养基2mL、菌悬液0.1mL、0.25mLPBS缓冲液(5%蔗糖－0.5mol/L)，加入0.05mL对照组和实验组溶液，放置于37℃厌氧培养箱24h，各试管与地面呈30°角培养。24h后将试管中的溶液缓慢移除，再用蒸馏水洗脱黏附在试管壁的细菌，反复洗涤3次，然后用离心机离心20min。用紫外分光光度计测定A550nm。

1.9葡萄柚－GSE对S.m产酸能力的影响

用二倍稀释法制备以下四个混合液浓度: 0.5、0.25、0.125、0.0625MIC(设空白对照组)，将pH值调定为7.4，按菌液与药物混合液1: 10(v/v)接种S.m，在37℃厌氧箱培养24h，离心20min，取上层清液，测定pH值，重复3次，取均值，计算△pH:△pH=起始pH－离心后pH［8］。

1.10统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行处理。结果以均数±标准差(±s)表示，用单因素方差对各组总体均数之间进行分析比较(Analysis of variance)。

2　结果

2.1变链菌在不同浓度蜂胶溶液和GSE溶液中的抑制情况见表1～2。

表1　不同浓度蜂胶溶液对S.m的抑制情况

表2　不同浓度GSE对S.m的抑制情况

由以上二表可判定，蜂胶MIC值为0.37500mg/mL，GSE的MIC值为0.04688mg/mL。

2.2不同浓度GSE溶液和蜂胶溶液混合液抑制变链菌的情况

见表3，由表中数据计算出分级抑制浓度指数:蜂胶与GSE联用时，其MIC值为0.09375mg/mL，GSE与蜂胶联用时，其MIC值为0.04688mg/mL，可得FICI =0.82。表明蜂胶与GSE联用时为相加作用。

表3　蜂胶－GSE混合液抑制S.m光密度值(±s)

＊P＜0.05有统计学意义，与阴性对照组比较

GSE(mg/ml)蜂胶(mg/mL) 〗0.37500　0.18750　0.09375　0.04688 0.37500　0.237±0.07＊　0.244±0.02＊　0.249±0.09＊　0.799±0.03＊0.18750　0.252±0.02＊　0.306±0.11＊　0.363±0.10＊　0.813±0.12＊0.09375　0.301±0.14＊　0.327±0.05＊　0.802±0.04＊　0.890±0.04＊0.04688　0.325±0.09＊　0.340±0.16＊　0.924±0.02＊　0.981±0.13＊0.02344　0.670±0.18＊　0.917±0.01＊　0.975±0.03＊　1.002±0.01＊阳性对照　0.305阴性对照　1.584空白对照0.108

2.3混合液对S.m黏附作用的影响

从表中可看出随着混合液浓度的增加，变形链球菌的黏附抑制率逐渐升高［9］。经统计学分析，实验组各浓度组与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05)，实验组各浓度组间也存在统计学差异(P＜0.05)。

表4　　蜂胶－GSE混合液对S.m黏附的影响(±s)

＊P＜0.05有统计学意义，与阴性对照组比较.

混合液浓度　1/16MIC　1/8MIC　1/4MIC　1/2MIC　　空白对照(TPY) 0.258±0.013黏附抑制率(%)吸光度值　0.236±0.027　0.210±0.014　0.178±0.012　0.147±0.090＊10.28　19.49　34.36　47.54　　－

2.4混合液对S.m产酸能力的影响

结果显示:随混合液浓度的增加S.m的产酸能力明显降低。各浓度组与阴性对照组均有统计学差异(P＜0.05)。

表5　蜂胶－GSE混合液对S.m产酸的影响(±s)

＊P＜0.05有统计学意义，与阴性对照组比较。

混合液浓度　0.0625MIC　0.125MIC　0.25MIC　0.5MIC　　空白对照(TPY) .0202　3.27±0.0215 △pH值　3.23±0.0198　3.18±0.0217　3.05±0.0245　2.81±0

3　讨论

根据实验结果判定蜂胶MIC值为0.37500mg/mL，GSE的MIC值为0.04688mg/mL，GSE与蜂胶联用时，其MIC值为0.04688mg/mL，蜂胶与GSE联用时，其MIC值0.09375mg/mL，根据公式计算得FIC =0.82。这表明蜂胶与GSE联用时为相加作用［10］。本实验还观察了蜂胶和GSE混合液对S.m产酸的作用，实验发现随着混合液浓度的增加，S.m的△pH值降低，浓度为1/16MIC时抑制产酸能力最弱，浓度为1/2MIC △pH最小，其表明此时产酸量降低，抑制产酸能力增强。说明混合液能明显抑制S.m产酸［11］。

参考文献:

［1］谢远雯，林家成，邱荣敏，等.白假丝酵母菌对变形链球菌产酸能力的影响［J］.中华口腔医学研究杂志，2013，1: 35－38

［2］程瑞，王燕.蜂胶的生物学功能及其应用前景［J］.广东饲料，2012，8: 2128

［3］杨清岭.蜂胶与柠檬提取物混合液对变形链球菌作用的体外研究［J］.黑龙江医药科学，2014，6，37(3) : 4－7

［4］蒋琳，林居红，李小玉.蜂胶及自制蜂胶奥硝唑合剂对人牙龈成纤维细胞的毒性作用［J］.实用口腔医学杂志，2008，1: 124－128

［5］候晓薇，杨更森，郭兰英.蜂胶对变形链球菌的抑菌及黏附抑制实验［J］.现代空腔医学杂志，2003，17(1) : 24－25

［6］黄冰冰，樊明文，杨祥良，等.桔梗、甘草及其组成的复方对口腔病原菌生长影响的体外实验［J］.实用空腔医学杂志，2003，19 (2) : 148－150

［7］周学东，黄正蔚，李继遥，等.黄答对三种主要致龋菌生长、产酸及产胞外多糖的影响［J］.华西医大学报，2002，33(3) : 391－393 ［8］蔡爽，时清，李玉晶，等.蜂胶涂膜抗乳牙人工龋的体外研究［J］.首都医科大学学报，2006，27(3) : 294－297

［9］张向宇，李晓眠，郭卯丁，等.橘皮提取物对口腔常见致病菌的抑菌效果［J］.中国消毒学杂志，2007，24(3) : 248－250

［10］林昱，钟声，郑碧琼，等.葡萄柚漱口液抑制菌斑形成的体内研究［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2009，(2) :

［11］滕立群，吕奎龙，孟祥才，等.纳米羟基磷灰石抑制变形链球菌粘附的体外研究［J］.黑龙江医药科学，2006，6，29(3) : 20－21

(收稿日期:2015－03－17)