黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织及外周血中IL-8表达的影响

李会英 李国兴 崔佳 刘哲敏 杜宁 刘学聪 乔玉巧



·论著·

黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织及外周血中IL-8表达的影响

李会英 李国兴 崔佳 刘哲敏 杜宁 刘学聪 乔玉巧

目的 采用大肠杆菌脂多糖诱导大鼠牙周炎模型，观察黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织及外周血中白介素-8(IL-8)表达水平的影响。方法 选用50只8周龄SD大鼠，随机分成5组，每组10只，A组为正常对照组，B组为牙周炎组，C1、C2、C3组为黄芩苷治疗组(分别以0.01、0.1、1.0 μg/ml黄芩苷治疗)，治疗1周后处死大鼠采取其外周血及牙龈组织，采用微量样本多重蛋白定量技术(CBA)检测外周血中IL-8表达含量，采用酶联免疫法(ELISA)检测牙龈组织中IL-8的表达含量。结果 牙周炎组大鼠牙龈组织及外周血中IL-8表达含量均明显高于正常对照组(P<0.05)，黄芩苷治疗组大鼠牙龈组织中IL-8和外周血中IL-8表达含量均明显低于牙周炎组(P<0.05)，且C1、C2、C3组IL-8水平逐渐下降(P<0.05)。结论 黄芩苷可以降低牙周炎大鼠牙龈组织和外周血中IL-8的表达含量，抑制脂多糖对大鼠牙周组织的损伤作用。

黄芩苷；牙周炎；牙龈组织；外周血；IL-8

牙周炎是发生在牙齿支持组织的炎症破坏性疾病，其发病的始动因子主要为菌斑和细菌，细菌内毒素的主要毒性成分脂多糖(LPS)既可引起牙周局部组织的损害，又可引起宿主防御细胞释放多种炎性细胞因子[如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)和白介素-6(IL-6)等]，进一步导致牙周组织的损伤[1]。研究表明，IL-8是一种具有趋化、激活和调节中性粒细胞活性的炎性因子，参与牙周组织炎性反应[2]，可反映牙周炎的静止与活动水平，与牙周炎的治疗有关。黄芩苷的药理活性主要为抑菌、清热、抗炎、抗变态反应等[3]，本研究中牙周局部应用黄芩苷治疗大鼠实验性牙周炎，采用酶联免疫法(ELISA)和微量样本多重蛋白定量技术(CBA)分别检测大鼠牙龈组织和外周血中 IL-8的表达含量，观察大鼠牙龈组织及外周血中IL-8表达含量的改变，探讨黄芩苷治疗牙周炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康清洁级雄性8周龄SD大鼠50只(河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号1410084)，体重(220±20) g。大鼠适应环境1周后进行实验。使用实验动物中心的标准动物饲料喂饲大鼠，自由摄取水和食物。

1.1.2 主要药品与仪器：大肠杆菌ATCC O55:B5脂多糖 (美国sigma公司)，黄芩苷(中国药物生物制品检定所)，大鼠IL-8 CBA检测试剂盒(美国BD公司)；大鼠IL-8酶联免疫试剂盒(上海森雄科技有限公司)。流式细胞仪(美国BD公司)，SPECTRAⅠ酶标仪(澳大利亚CRYOLOGIC 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制:于2 ml 0.9%氯化钠溶液中溶解2 mg黄芩苷，加入碳酸氢钠调整pH值7.4，直至完全溶解为1 mg/ml的溶液，置于4℃冰箱保存备用，试验时用0.9%氯化钠溶液稀释至所需浓度；取10 mg LRS，用0.9%氯化钠溶液稀释至1 mg/ml的溶液。LPS终末浓度为1 mg/ml，黄芩苷终末浓度为0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2 动物分组及牙周炎模型的建立：将50只SD实验大鼠随机分为5组：A组为正常对照组、B组为牙周炎组、C1、C2、C3组分别为0.01、0.1、1.0 μg/ml黄芩苷治疗组，每组10只。A组除外，用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射,将B组、C1、C2、C3组大鼠麻醉成功后，在大鼠右侧上颌第1、2磨牙之间颊腭侧龈沟底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重复注射1次，连续3 d，每天探诊各组大鼠牙周袋深度，观察牙周组织、全身状况、毛发、食欲及粪便情况，直至1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3 黄芩苷的局部治疗：大鼠牙周炎模型形成后第2天开始用药，分别在C1、C2、C3组大鼠右侧上颌第1、2磨牙之间颊腭侧龈沟底注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黄芩苷溶液各0.2 ml，B组大鼠的同部位注射等量0.9%氯化钠溶液，连续用药3 d，各组分笼饲养。继续每天探诊5组大鼠牙周袋深度，观察5组大鼠牙周组织、全身状况、毛发、食欲及粪便情况。

1.2.4 动物处死及标本采集：用药后第7天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，于腹主动脉取血5 ml，3 500 r/min离心，取上清液，-70℃冰箱保存，用于外周血中IL-8含量的检测；用颈椎脱臼法处死各组大鼠，5 min内取其右上颌第1、2磨牙颊腭侧实验处新鲜牙龈组织，液氮骤冷后，-70℃冰箱保存，用于牙龈组织中IL-8含量的检测；再剪取各组大鼠的右上颌第1、2磨牙实验处的牙、牙槽骨及牙周组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗后，10%甲醛固定24 h，10%EDTA脱钙，石蜡包埋，制作磨牙颊腭向石蜡切片，每片厚度为5 μm，苏木精-伊红染色，置于光学显微镜下观察大鼠牙周组织病理变化情况。

1.2.5 大鼠外周血中IL-8表达含量的测定：将已分离的血清上清液标本从冰箱取出置于室温下，待溶解后采用微量样本多重蛋白定量技术(CBA技术)，通过流式细胞仪(美国BD公司)检测IL-8的含量，具体按试剂盒说明书操作。

1.2.6 大鼠牙龈组织中IL-8 表达含量测定：将采集的牙龈组织从冰箱取出置于室温下，待溶解后准确称重，按重量体积比加缓冲液PBS制备成10%的组织匀浆，2 000 r/min离心10 min，取其上清液，采用LISA法检测IL-8含量，具体按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验和方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 注射LPS后第2天，B组、C1、C2、C3组大鼠开始出现神态萎靡、活动减少、皮毛疏松、进食水减少、大便较干燥，随着注射LPS次数的增加，上述症状逐渐加重；B组局部注射0.9%氯化钠溶液后大鼠牙龈仍明显肿胀，神态倦怠、活动较少、皮毛无光泽、进食水较少、大便干燥，上述症状无明显改善；C1、C2、C3组大鼠注射黄芩苷治疗后，全身状态逐渐改善，神态趋于正常，皮毛光泽改善，进食、活动增多，以C3组效果最明显。实验期间A组大鼠神态、活动、皮毛光泽、饮食水、大便均正常。

2.2 大鼠口腔肉眼观察 注射LPS后第2天，B组、C1、C2、C3组大鼠开始出现牙龈组织出现充血肿胀，探之易出血，随着注射LPS次数的增加，上述症状逐渐加重，注射LPS后1周牙周袋形成，探诊深度4～5 mm；B组大鼠局部注射0.9%氯化钠溶液后，牙龈仍明显肿胀，牙周袋深度4～5 mm；C1、C2、C3组大鼠注射局部黄芩苷治疗后，全身状态明显改善，牙龈组织充血肿胀减轻，牙周袋变浅，探诊深度3～4 mm；实验期间A组大鼠表现无明显变化，牙龈组织无充血肿胀，无牙周袋形成。

2.3 大鼠牙周组织病理变化 光镜下可见，B组牙龈上皮形成溃疡，部分坏死，牙周袋内炎性细胞浸润明显，固有层血管扩张及淋巴细胞渗出明显，牙周膜纤维排列不齐，牙槽嵴表面部分吸收明显，牙槽骨可见破骨细胞、骨吸收陷窝，骨质疏松；C1、C2、C3组牙周组织表现较牙周炎组明显好转，牙周膜及牙槽骨结构趋于正常，牙周袋变浅，炎性细胞浸润减少，固有层血管扩张及淋巴细胞渗出减轻，牙周膜纤维束排列较整齐，牙槽骨内破骨细胞、骨吸收陷窝较少，骨质疏松明显减轻；A组牙周膜纤维排列整齐，牙槽骨表面光滑，无明显破骨细胞和骨吸收陷窝形成，牙龈上皮和上皮下结缔组织结构较完整。见图1。

图1 光镜下5组牙周组织形态(HE×4)

2.4 黄芩苷对大鼠外周血和牙龈组织中IL-8表达含量的影响 牙龈组织大鼠外周血牙周炎组中IL-8含量明显高于正常对照组(P<0.05)，而C1、C2、C3组IL-8含量均较B组明显降低(P<0.05)，且C1、C2、C3组的IL-8含量逐渐下降(P<0.05)。见表1,图2。

表1 2组组织及其外周血中IL-8的表达 n=100，±s

表1 2组组织及其外周血中IL-8的表达 n=100，±s

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与牙周炎组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与C2组比较,☆P<0.05

组别牙龈组织中IL-8(μg/L)外周血中IL-8(pg/ml)正常对照组0.122±0.0251.00±0.00牙周炎组0.708±0.038*1.95±0.07*C1组0.524±0.041*#1.72±0.04*#C2组0.374±0.029*#△1.53±0.06*#△C3组0.192±0.034*#△☆1.36±0.05*#△☆

图2 黄芩苷对大鼠牙龈组织及其外周血中IL-8的表达含量的影响

3 讨论

牙周炎是由革兰氏阴性(G-)细菌等引起的一种以骨破坏为主要特征的慢性细菌感染性疾病，其中革兰氏阴性厌氧菌及其内毒素可引起宿主局部免疫细胞反应,激活宿主防御细胞释放多种炎性细胞因子，继发引起牙龈组织炎症、牙槽骨破坏和吸收等牙周组织损伤[4，5]。LPS是G-菌胞壁外膜中的内毒素的主要成分,是G-菌所独有的一种对牙周组织具有很高毒性的致病物质，LPS的化学组成在不同微生物之间有所不同，但其基本结构相似，类脂A是LPS的生物活性中心，无种属特异性，在各种G-菌中的化学成分和结构相似，可引导其所有的生物学反应,因此不同G-菌来源的LPS产生的毒性作用相似[6]。根据文献采用大肠杆菌LPS诱导的大鼠实验牙周炎模型,操作简便、可比性及重复性强[5]。本实验采用大肠杆菌LPS进行实验，连续3 d在大鼠右上颌磨牙同一部位的牙龈组织中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙龈红肿,探诊出血。光镜下显示，炎性细胞、破骨细胞浸润,牙槽骨开始吸收。

IL-8是一种内源性中性粒细胞趋化因子和破骨细胞活化因子，单核细胞、巨噬细胞、 中性粒细胞、牙龈成纤维细胞等在白细胞介素-1(IL-1)、TNF-α、LPS等刺激下，均能产生IL-8，IL-8通过趋化和活化中性粒细胞释放各种酶，吞噬、杀伤、消化细菌，造成组织病理性炎症损害和骨质吸收[7，8]。谢昊等[9]研究发现，血清IL-8在牙周炎患者中的检出率明显高于在健康对照组的检出率，表明IL-8与牙周炎症的发生发展密不可分，是促进牙周炎症的一种重要炎性介质。米丛波等[10]研究发现，在牙龈组织发生炎症时，IL-8在磨牙的压力侧牙周组织中的表达增强，尤其在牙周膜成纤维细胞浆及破骨细胞中表现高强度表达，与正常对照组比较，IL-8在牙周炎组牙周组织中的表达强度显著增高，牙槽骨内骨吸收陷窝明显增多，而IL-8在正常组大鼠的牙周组织中仅少量表达，表明IL-8可介导牙周炎症发生、提高破骨细胞活性，与牙周炎症发生发展有密切关系。有学者研究发现，牙周炎患者龈沟液及外周血中的IL-8等细胞因子含量明显升高，促进炎性细胞进入感染部位，造成牙周组织的破坏[11,12]。因此，在牙周炎的临床治疗中，抑制IL-8等炎性细胞因子的生成，对牙周炎有积极的治疗意义。

黄芩苷具有抑菌、清热、抗炎、抗变态反应等药理活性，可显著抑制脂多糖对炎性细胞因子的诱导合成，增强牙龈成纤维细胞活性，促进牙龈成纤维细胞有作用促进细胞合成胶原和蛋白质，抑制牙周组织的炎性反应[13-15]。有研究发现黄芩苷对内毒素还有较好的直接降解作用，其降解作用具有时间和浓度依赖性，黄芩苷局部治疗牙周病可以有效改善临床及细菌学指标[4,16]。虽然目前化学药物局部应用治疗牙周炎的疗效也比较明显，但化学药物对致病菌仅是直接杀菌作用，对菌体溶解后产生的内毒素却不能产生降解作用，并且毒副作用大、不良反应多、耐药性强，应用受到局限，而黄芩苷既对内毒素有直接降解作用，又可抑制炎性因子的合成，促进牙周成纤维细胞的活性，黄芩又是我国传统中药，来源丰富、价格低廉、毒副作用小，因此利用黄芩苷防治牙周病具有广阔的前景。

本实验结果显示，局部注射黄芩苷治疗后，与牙周炎组相比，黄芩苷治疗组大鼠的牙周及一般情况均有明显好转，各治疗组大鼠牙龈组织充血减轻，牙周袋变浅，神态趋于正常，皮毛光泽改善，进食水、活动增多；黄芩苷各治疗组牙龈组织中和其外周血中IL-8的表达含量均明显低于牙周炎组，随着黄芩苷浓度升高，IL-8表达水平逐渐降低，表明黄芩苷可降低实验性牙周炎大鼠牙龈组织中和其外周血中IL-8的表达水平，抑制IL-8的分泌和合成，减少炎性介质的释放，减轻机体炎性反应，抑制牙槽骨吸收，提示临床上局部应用黄芩苷治疗牙周炎，可抑制牙周组织的炎性反应，对牙周炎的恢复有一定的疗效。

总之，本研究提示黄芩苷可改善牙周炎大鼠的牙周及一般状况，降低牙周炎大鼠牙龈组织和外周血中IL- 8的表达水平，阻断脂多糖对大鼠牙周组织的损伤，但具体作用机尚需进一步研究。

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Effects of baicalin on the expression levels of interleukin-8 in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital.Shijiazhuang050031,China

Objective To observe the effects of baicalin on the expression levels of interleukin-8 in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis induced by colibacillus lipopolysaccharide (LPS).Methods Fifty SD rats (8-week age ) were randomly divided into five groups,with 10 rats in each group, which were control group (group A), periodontitis group (group B),low-dose baicalin treatment group (0.01μg/ml,group C1),median-dose baicalin treatment group (0.1μg/ml,group C2),high-dose baicalin treatment group (1.0μg/ml,group C3). After 1-week treatment, these rats were sacrificed,and the specimens of gingival tissues and peripheral blood were obtained,then the expression levels of IL-8 in peripheral blood of rats were measured by cytometric bead array (CBA),and the expression levels of IL-8 in gingival tissues of rats were detected by ELISA.Results The expression levels of IL-8 in peripheral blood in group B were significantly higher than those in control group (P<0.05).The expression levels of IL-8 in gingival tissues and peripheral blood in the three baicalin treatment groups were significantly higher than those in group B (P<0.05),moreover, the expression levels of IL-8 in group C1, C2, C3 were gradually decreased in order (P<0.05).Conclusion The baicalin can decrease the expression levels of IL-8 in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis and can inhibit the destructive effects of LPS on periodontal tissues of rats.

baicalin; periodontitis; gingival tissues；peripheral blood；interleukin-8

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.002

项目来源：河北省中医药管理局中医药类科研计划课题(编号:2013181)

050031 石家庄市，河北省儿童医院口腔科

刘学聪，050031 石家庄市，河北省儿童医院口腔科；

E-mail:lgxlhy@163.com

R 781.4

A

1002-7386(2016)22-3369-04

2016-05-23)