进展期胃癌Rb蛋白表达与E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞中再表达的关系及临床意义

张宇龙 张国栓 范晓燕 崔专义



·论著·

进展期胃癌Rb蛋白表达与E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞中再表达的关系及临床意义

张宇龙 张国栓 范晓燕 崔专义

目的 探讨进展期胃癌Rb蛋白表达与E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达情况及与临床病理因素的关系。方法 免疫组织化学染色方法检测Rb在原发灶和E-cadherin及β-catenin在86例进展期胃癌原发灶及相应淋巴结癌细胞表达情况。结果 胃癌原发灶中65.12%出现Rb阳性，46.51%转移淋巴结内癌细胞中出现E-cadherin及β-catenin的再表达阳性，Rb与肿瘤的分化程度、病理类型密切相关(P<0.05)，E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结内的再表达阳性与肿瘤的分化程度密切相关(P<0.05)，E-cadherin在转移淋巴结内的再表达与肿瘤的病理类型密切相关(P<0.05)，β-catenin在转移淋巴结内的再表达与肿瘤的病理类型无关(P>0.05)，Rb的表达与E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结内癌细胞中的再表达情况、肿瘤的大小及浸润程度无关(P>0.05)。E-cadherin与β-catenin在转移淋巴结内再表达存在相关关系(P<0.05)，Rb在肿瘤原发灶表达与E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达无相关关系(P>0.05)。结论 Rb的表达与进展期胃癌的发展过程密切相关，E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞的再表达是进展期胃癌发生的重要事件，二者协同发挥作用，并对癌细胞在转移灶中的聚集起重要作用，联合评价其功能具有重要临床意义。

Rb；E-cadherin及β-catenin；进展期胃癌；转移淋巴结；再表达；免疫组织化学；生存期

上皮钙粘蛋白(E-cadherin)属钙依赖钙粘着素家族成员，主要分布于非神经细胞上皮组织，介导同种细胞-细胞间的黏附。E-cadherin功能须与配体-连接素(catenin)结合成复合体才能起作用，其表达异常与多种恶性肿瘤的浸润、转移及预后密切相关[1]。 E-cadherin与β-catenin直接结合，α-、γ-catenin则介导E-cadherin/β-catenin与细胞骨架的肌动蛋白连接，其黏附功能降低是肿瘤发生、发展的重要原因。视网膜母细胞基因(Rb基因)是重要肿瘤抑制基因，与细胞内调控元件细胞蛋白及转录因子相互作用而调控细胞生长，同时Rb蛋白又受多因子在多层次上的调控，使其功能与细胞生长、分化相适应[2]，在细胞周期发挥重要调控作用。本实验采用SP免疫组化法，检测Rb与E-cadherin、β-catenin 在进展期胃癌细胞及其相应转移淋巴结细胞中的表达状况，探讨其与进展期胃癌临床病理因素及其相互之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2009年6月至2012年6月于我院外科手术切除并经病理证实的进展期胃癌标本86例，男70例，年龄37～75岁；女16例，年龄42～72 岁，平均年龄59.2岁。其中71例获随访。胃癌组织病理类型包括黏液腺癌21例、管状腺癌57例、印戒细胞癌4例和腺磷癌2例、未分化癌1例，磷癌1例。其中高分化14例，中分化21例，低分化51例；侵及浆膜层78例，未侵及浆膜8例。入选病例均未进行化疗或放疗，无长期服用非甾体类抗炎药物及皮质激素药物史。

1.2 试剂 兔抗人多克隆NF-κB、及β-catenin抗体购于NeoMarkers 公司，鼠抗人单克隆E-cadherin 抗体购于ZYMED 公司，SP法试剂盒购于北京中杉公司。

1.3 方法 标本以10%甲醛固定,石蜡包埋，4 μm切片。采用免疫组化SP法，试剂盒使用依说明书，切片常规脱蜡，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，微波抗原修复，5%羊血清处理20 min后，滴加NF-κB一抗4℃一夜, 以DAB显色，以苏木素复染；PBS代替一抗为阴性对照，以切片上相对正常之黏膜组织为阳性对照。

1.4 结果判定

1.4.1 E-cadherin及β-catenin染色评级：二者只有明显细胞膜染色被判定为正常染色；如染色不连续，或明显减弱、缺失，或者出现细胞浆染色，则被评定为不正常染色。每张切片按所有癌细胞之中的正常染色的细胞的百分比评定为三级：1级0～50%；2级51%～80%；3级81%～100%[3]。

1.4.2 评级表达判定：原发灶如被评定为3级，则此病例则被认为是E-cadherin、β-catenin的正常表达，而1级与2级染色则被认为是E-cadherin、β-catenin的不正常表达；对于其转移淋巴结，如染色评定为3级而原发灶为1级或2级，或转移淋巴结染色评定为2级而其原发灶染色为1级，则此病例则被评定为E-cadherin、β-catenin再表达阳性；否则评定为再表达阴性。

1.4.3 Rb蛋白显色评分：Rb蛋白显色阳性细胞百分比≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分；基本不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，将两类积分相乘0～1分为阴性,≥2分为阳性。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件,计数资料比较采用χ2检验，应用Sperman秩相关法分析各指标表达的相关性，绘制Kaplan-Meier曲线比较患者术后生存情况，以Wilcoxon’s log-rank test 对生存曲线行组间差别检验，用Cox’s proportional-hazard对影响生存率的因素进行多变量分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 E-cadherin及β-catenin在原发灶癌细胞的表达 86例进展期胃癌中，E-cadherin及β-catenin在原发灶癌细胞中绝大部分出现胞膜染色减弱或者缺失，部分甚至并出现胞浆染色。其不正常率分别为95.35%(82/86)与96.51(83/86)，仅1例在癌原发灶细胞中两种蛋白表达均为正常。

2．2 E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达及其与临床病理因素的关系 E-cadherin及β-catenin于转移淋巴结癌细胞中再表达率分别为39.53%、25.58%。86例病例中，共40例出现一种及一种以上蛋白阳性，26例出现一种连接蛋白阳性，另有14例出现两种连接蛋白阳性。E-cadherin于高中分化癌之转移淋巴结癌细胞的再表达率为57.14%，高于低分化癌之转移淋巴结癌细胞的再表达率27.45%(P<0.05)；β-catenin在高中分化癌之转移淋巴结癌细胞的再表达率为37.14%，高于低分化癌之转移淋巴结癌细胞的再表达率17.65%(P<0.05)。E-cadherin再表达与肿瘤细胞病理分型(印戒细胞癌、未分化癌、磷癌及腺磷癌因样本过小，故未予统计)密切相关(P<0.05)；β-catenin再表达与肿瘤细胞病理分型无关(P>0.05)。E-cadherin、β-catenin均与肿瘤大小及浸润深度无关(P>0.05)。见表1。

2．3 Rb在原发灶癌细胞的表达 86例进展期胃癌组织中Rb阳性表达56例，阳性率达65.12%，阳性染色见于胞浆和胞核。Rb表达与进展期胃癌的的分化程度密切相关(P< 0.05)；与肿瘤细胞的病理分型(印戒细胞癌、未分化癌、鳞癌及腺鳞癌因样本含量过小，故未予统计)、肿瘤大小及肿瘤浸润深度无关(P>0.05)。见表2。

2．4 E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达及与Rb表达的相关性 22例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阳性者中有14例E-cadherin再表达阳性，64例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阴性者中有44例E-cadherin再表达阴性，β-catenin、E-cadherin在转移淋巴结癌细胞再表达密切相关(P<0.05)。34例E-cadherin转移淋巴结癌细胞再表达阳性者中30例Rb阳性表达，51例E-cadherin转移淋巴结癌细胞再表达阴性者中有12例Rb阴性表达，E-cadherin转移淋巴结癌细胞再表达与Rb的表达无关(P>0.05)。22例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阳性者中有18例Rb阳性表达，64例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阴性者中有12例Rb阴性表达，β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达与Rb的表达无关(P>0.05)。

表1 Rb的表达和E-cadherin与β-catenin的再表达与临床病理因素的关系 例

表2 Rb表达与E-cadherin及β-catenin再表达与患者预后的关系

2.5 Rb的表达与E-cadherin及β-catenin在转移淋巴结癌细胞的再表达与患者预后的关系 86例患者中71例获随访，由手术之日起至随访结束，平均生存时间36.2个月(7～68个月)。获随访71例患者3年生存率仅30.9%。其中β-catenin再表达阳性者生存均数95%CI(19，30)，其中位生存时间23个月，再表达阴性者生存均数95%CI(34，47)，中位生存时间31个月，再表达阳性与阴性间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；E-cadherin再表达阳性者生存均数95%CI(24，35)，中位生存时间23个月，再表达阴性者生存均数95%CI(32，47)，中位生存时间28个月，再表达阳性与阴性间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Rb蛋白表达阳性者生存均数95%CI(29，41)，中位生存时间25个月，表达阴性者生存均数95%CI(28，44)，中位生存时间30个月，表达阳性与阴性间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。生存曲线进行组间差别检验，差异无统计学意义(P>0.05)。多变量分析发现，β-catenin在胃癌转移淋巴结癌细胞再表达可作为预后的一个独立因素(P<0.05)。见表3、4,图1～3。

图1 E-cadherin再表达情况与预后关系生存曲线

图2 β-catenin再表达情况与预后关系生存曲线

图3 Rb表达情况与预后关系生存曲线

表3 组间两两比较

3 讨论

E-cadherin、β-catenin与维持正常上皮组织结构具有重要作用。对许多上皮源性恶性肿瘤细胞来说，某些原因作用下的E-cadherin、β-catenin功能障碍都可能会造成肿瘤细胞间的黏附功能破坏，癌细胞间黏附功能破坏进而癌细胞脱离原发灶导致转移。Bukholm等[4]注意到乳腺癌患者转移灶癌细胞中β-catenin再表达的情况。另外，β-catenin是wnt基因家族控制信号传导通路重要成分，在表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、c-erb-B2及src基因等诱导下，发生酪氨酸磷酸化，并迅速影响与之相连的E-cadherin或APC,改变细胞黏附复合物的活性，促进细胞运动及癌细胞的侵袭和转移[5-7]。

表4 多变量分析

国内外研究显示，钙粘蛋白-连接素复合物在胃癌的异常表达率为20%～90%[6-8]。本研究结果发现仅在极少的病例中，肿瘤原发灶癌细胞E-cadherin、β-catenin正常表达，即其黏附功能正常，本研究与以往报道数据的差异可能由于本研究所取样本均为进展期胃癌而不包括早期胃癌造成的。在转移淋巴结癌细胞，E-cadherin及β-catenin再表达阳性率为39.53%、25.58%。该远高于原发灶癌细胞正常表达率的再表达阳性率，说明就如E-cadherin与β-catenin在原发灶的不正常表达与癌细胞自原发灶脱落有关一样，其在转移灶内的再表达阳性与癌细胞在转移部位的再聚集和生长有关[9]。原发灶中该复合物的非正常表达与癌细胞的脱离和转移关系密切，在转移淋巴结癌细胞中较高再表达则造成癌细胞在转移淋巴结中的聚集。E-cadherin与β-catenin在转移淋巴结癌细胞中的再表达呈正相关，说明E-cadherin与β-catenin可能偕同作用于原发灶癌细胞的脱落以及脱落癌细胞的淋巴结转移，而且E-cadherin与β-catenin可能共同促进转移癌细胞在淋巴结内的聚集并形成转移灶。本研究还表明，E-cadherin与β-catenin的再表达与患者预后呈正相关。

Rb基因是定位于染色体长臂(13q14)，主要通过抑制转录因子E2F阻止细胞周期，对细胞生长、分化起调控作用。Rb基因正常情况下对细胞分裂起重要抑制作用，这种抑制作用减弱导致细胞可能发生异常增殖，最终发生癌变。Rb基因对细胞增殖分化的调控与多个因子如cyclins、CDKs、TGF-β2参与相关。p16-cyclinD1-pRb和p53-p21-pRb通路是细胞周期中G1-S期转变的两条独立分子信息传导途径，Rb蛋白在细胞周期调节中起着重要作用。Rb蛋白功能与磷酸化状态密切相关。一方面，磷酸化Rb蛋白与转录因子E2F结合，细胞增殖停滞于G1期，有助于细胞DNA的损伤修复；另一方面，磷酸化Rb蛋白抑制细胞由G0-G1期转化所必须的c-myc与c-fos癌基因表达。当由于某些原因致Rb蛋白磷酸化水平升高，导致转录因子E2F激活并释放，DNA复制，细胞过度增殖，细胞于G1期未充分发育便进入S期，有可能导致恶性肿瘤的发生[10-12]。

He[13]发现C-mgc基因是β-Cat-Tcf/lef复合物的靶基因。此外，细胞周期素(cyclinD1，CD1)是作用于G1期的细胞周期相关蛋白，促进细胞由G1/G0期进入S期。可见Rb与β-catenin在肿瘤原发灶的发生、发展中存在一定的相关性。Rb作为一种重要的抑癌基因，本应在原发灶肿瘤细胞中呈低表达，但本研究发现，Rb蛋白在原发灶肿瘤细胞中为65.12%的高阳性率，从理论上讲，Rb的表达抑制细胞的增殖，不利于肿瘤的演进。不是所有的Rb基因突变均可测到Rb蛋白的缺失，相反，可能导致一种无功能的Rb蛋白，即突变型的Rb蛋白表达。而有学者证实野生型Rb蛋白有抑制细胞增殖的功能，突变型的Rb蛋白则失去抑制作用[14]。本研究也表明，Rb蛋白的表达与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达有相关性，二者很可能有共同的作用基因，不仅在原发灶癌细胞中发生作用时有一定相关性，并且可能与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达也有一定关系，但具体机制不清。本研究与既往研究一致表明，Rb基因与患者的预后密切相关。

综上所述，E-cadherin与β-catenin功能异常很可能是肿瘤发生、发展过程中的重要环节，可能与其他因素协同作用促进肿瘤的发生、发展。在进展期胃癌转移淋巴结癌细胞存在E-cadherin与β-catenin的再表达情况与患者预后密切相关。Rb在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达有关，并且与患者预后密切相关。

1 Tamura S.The E-cadherin,edeated cell-cell adhesion system in human cancers.Br J Surg,1997,84:899-900.

2 Weiberg RA. The retinoblastoma and cell cycle control.Cell,1995,81:323-327.

3 Andrews NA, Jones AS, Heliwell TR, et al. Exression of the E-cadherin-catenin cell adherin complex in primary squamous cell carcinoma of the head and neck and their nodal metastases. Br J Cancer, 1997, 75:1474-1480.

4 Bukholm IK, Nesland JM, Borresen Dale Al.Re-expression of E-cadherin,α-andβ-catenin, but not of γ-catenin, in metastatic tissue from breast cancer patients.J Pathol,2000,190:15-19.

5 Shibamoto S, Haya Kawa M, Takeuchi K, et al.T yrosine phosphorylation of β-catenin and plakoglobin enhanced by heprocyte growth factor and epidermal growth factor in human carcinoma cells.Cell Adhesion and Communication,1994,1:295.

6 Ochiai A, Aakimoto S, Kana Y, et al.C-erbB-2 gene product associates with catenins in human cancer cells.Biochem Biophys Res Commun,1994,205:73.

7 Papkoff J. Regulation of complexed and free catenin pools by distinct mechanisms: Differential effects of Wnt-1 and src. J Biolchem,1997,272:4536.

8 戴冬秋, 陈峻青, 徐惠绵, 等. E-钙黏附素及α-链接素的表达与胃癌生物学行为及淋巴结转移规律的关系. 中华肿瘤杂志,2001,23:35-38.

9 刘津，池口正英，阎庆辉，等. 钙黏蛋白链蛋白复合体在进展期胃癌转移淋巴结的再表达及其临床意义. 中华实验外科杂志,2004,21:535-537.

10 Peter M, Herskowitz I. Joining the complex: cyclin-depedent kinase inhibitory proteins and the cell cycle.Cell,1994,79:181.

11 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436-440.

12 Gunther T, Schheider-Stock R, Pross M, et al.Alterations of the Rb/MTS1- tumor suppressor gene in human cancer.Pathol Res Pract,1998,194:809-813.

13 He TC. Identifition of c-myc as a target of the APC pathway.Science,1998,281:1509.

14 Robbims PO, Horonitz JM, Mmalligan RC,et al.Negative regulation of human C-fos expression by retinoblastomas gene product.Nature,1990,346:668.

Expression and clinical significance of Rb protein, E-cadherin and β-catenin in metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma

ZHANGYulong,ZHANGGuoshuan,FANXiaoyan,etal.DepartmentofSurgery,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of Rb protein as well as the re-expression of E-cadherin and β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma.Methods The expression levels of Rb protein in primary focus, and expression levels of E-cadherin and β-catenin were detected by immunohistochemistry in primary focus of 86 cases of advanced gastric carcinoma and the corresponding metastatic lymph nodes. Results In primary focus of gastric cancer, the positive rate of Rb protein was 65.12%, and the positive rate of re-expression of E-cadherin and β-catenin was 46.51% in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma,moreover, the expressions of Rb were closely correlated to the differentiation degree and pathological types of tumor (P<0.05). The re-expression levels of E-cadherin and β-catenin in metastatic lymph nodes were closely related with the differentiation degree of tumor (P<0.05). The re-expression levels of E-cadherin in metastatic lymph nodes were closely correlated to the pathological types of tumor (P<0.05), however, the re-expression levels of β-catenin were not correlated to the pathological types of tumor (P>0.05).The re-expression levels of Rb protein were not correlated to those of E-cadherin and β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes,and to tumor’s size and infiltration degree (P>0.05). The re-expression of E-cadherin was closely correlated to that of β-catenin in metastatic lymph nodes (P<0.05),however, the expression levels of Rb protein in primary focus of tumor were not related with those of E-cadherin or β-catenin in metastatic lymph nodes (P>0.05). Conclusion The expression of Rb protein is closely correlated to the pathogenesis and development of advanced gastric carcinoma. The re-expressions of E-cadherin and β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma play an important role in the pathogenesis of advanced gastric carcinoma,with a synergism effect,thus, combination detection of E-cadherin with β-catenin has important clinical significance in evaluating their effects in tumor metastasis.

Rb; E-cadherin;β-catenin; advanced gastric carcinoma; metastatic lymph nodes; re-expression; immunohistochemically; survival time

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.003

050011 河北省石家庄市第一医院外三科

张国栓，050011 河北省石家庄市第一医院外三科；

E-mail：zgs4898@163.com

R 735.2

A

1002-7386(2016)22-3373-05

2016-02-11)