ANXA3在乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系
2016-12-06周涛李勇杨丽李春晓王占东刘月平
周涛 李勇 杨丽 李春晓 王占东 刘月平
·论著·
ANXA3在乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系
周涛 李勇 杨丽 李春晓 王占东 刘月平
目的 探讨ANXA3 在乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系。方法 通过免疫组化 MaxvisionTM法回顾性检测153例乳腺癌患者肿瘤组织中ANXA3的表达情况，比较ANXA3阳性表达组(n=96)与ANXA3阴性表达组(n=57)与临床病理指标的关系。结果 ANXA3蛋白阳性表达率为62.7%，且与组织学分级、腋窝淋巴结转移状态呈正相关，ANXA3蛋白高表达与患者年龄、月经状态、肿瘤大小及临床分期差异无统计学意义(P>0.05 )。亚组进一步分析，ANXA3在三阴性乳腺癌患者中阳性表达率(80.65%)明显高于其他类型(χ2=8.207，P=0.042)，但在其他亚组之间ANXA3表达无统计学差异(χ2=0.951，P=0.622)。结论 ANXA3阳性表达与乳腺癌组织学分级及转移淋巴结个数呈正相关，在促进乳腺癌的发生、发展及转移中可能有一定的作用。ANXA3高表达可能预示乳腺癌预后差。
Annexin A3；乳腺肿瘤；淋巴结转移，组织学分级
在全世界范围，乳腺癌已经是仅次于肺癌的全球发病率第二位的恶性肿瘤，同时乳腺癌是女性发病率最高的癌症。近年来乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，在欧美等国家乳腺癌占女性恶性肿瘤的25%～30%。尽管乳腺癌的发病率在逐年升高，但乳腺癌的病死率却呈现逐年下降的特点。原因可归结为乳腺癌知识的普及，人们定期体检意识的增强，诊断水平的进步以及局部、全身系统治疗的不断发展和更新等。总之，乳腺癌的诊疗正在从局部向全身系统治疗方向转化。了解乳腺癌发生、发展的分子机制对于治疗乳腺癌和提高乳腺癌患者的生存率具有决定性的意义。因此，是否能够找到对乳腺癌的诊治具有帮助的特异生物学标志物是目前的工作重点。 膜联蛋白(Annexin)是一类磷脂结合蛋白家族，本身具有钙离子依赖性，参与细胞骨架组成并可以调控细胞与细胞外基质相互作用[1]。Annexin家族包括：A、B、C、D、E5类，我们人类为Annexin A类，目前被发现的有AnnexinA1～A13(AnnexinA12缺失)12种，Annexin家族成员具有多种生物活性，如细胞增殖、分化、凋亡、凝血、抗炎以及细胞内外信号转导等[2]。Annexi蛋白家族结构特点：由大约70个高度α螺旋结构的氨基酸残基组成4个高度相似的结构区域组成C末端，而N末端高度可变，是区分不同Annexin家族成员的主要标志，是由20～200个氨基酸残基组成[3,4]。Annexin表达水平失调与诸多肿瘤存在相关性，其表达水平与肿瘤的组织分级、临床分期、肿瘤的转移侵袭能力可能存在一定的相关性，在目前研究中越来越受到重视，成为目前研究热点。膜联蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)是Annexins家族成员之一，在肿瘤的形成、增殖、凋亡和信号转导形成过程中都扮演重要角色，ANXA3表达水平的改变，对肿瘤发生发展、耐药性、转移有重要影响[5]。本研究通过免疫组化法检测Annexin A3在乳腺癌组织中的表达水平，探讨其表达与临床病理特征的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料 河北医科大学第四医院乳腺疾病诊疗中心2009年1～6月，所有病历资料均经病理证实、且具有完整随访资料。原发性女性乳腺癌153例，年龄22～76岁，中位年龄47岁；Ⅰ期29例、Ⅱ期108例、Ⅲ期16例；临床分期采用TNM分期(2003年)AJCC第6版；病理类型包括：浸润性小叶癌17例、浸润性导管癌101例、髓样癌14例、其他21例(鳞癌、黏液腺癌、管状腺癌、富脂质癌等)；其中腋淋巴结转移≥4个34例，占全部患者22.2%。所有患者均按照美国国家综合癌症网(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)乳腺癌临床实践指南(2008年版)，接受规范的治疗(包括手术和/或放、化疗)。
1.2 试剂及检测方法 试剂：ER(SP1)、PR(SP2)购自福州迈新公司。Her-2(4B5)、Ki-67(30-9)购自罗氏公司。FISH基因扩增试剂盒(CPD0009)购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。检测方法：免疫组化检测采用MaxvisionTM法：肿瘤标本经石蜡包埋、水化后，4 μm 厚切片，进而采取蒸馏水冲洗3遍，120 s/次，应用3%过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化酶，并孵育10 min，复用蒸馏水冲洗3次，120 s/次，进行组织抗原修(压力锅)，应用pH值7.4的PBS液洗涤冲洗3遍，5 min/次，4%羊血清滴加封闭，室温放置30 min，减少非特异性染色。再滴加一抗后室温孵育1 h。PBS液洗涤3次，5 min/次。按说明滴加二步法Maxvision TM/HPR后孵育15 min，PBS液再次洗涤冲洗3遍，5 min/次。去除PBS液后每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，于显微镜下观察显色效果，棕黄色或棕褐色为阳性信号。平均显色时间为5 min左右，而后终止反应，采用自来水充分洗涤冲洗。复染苏木素，0.1%盐酸酒精分化，再次自来水洗涤冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，最终应用中性树胶封片，病理医师阅片并判定染色结果。
1.3 结果判定 由2名专业的病理科主任医师阅片诊断。
1.3.1 ER/PR判定标准[6,7]：按照国际通用标准判定免疫组化检测结果，ER/PR表达阴性：癌细胞胞核着色，棕黄色着色<10%；ER/PR表达阳性：癌细胞胞核着色，棕黄色着色≥10%。
1.3.2 ANXA3判定标准：ANXA3主要为镜下癌细胞胞质着色。免疫组化评分标准分别为阳性细胞胞质染色强度及判定为阳性细胞数占全部细胞的比例。结果评定标准如下[8]：①阳性细胞数数目评分：每片于镜下随机观察5个高倍视野，癌细胞胞质染色阳性细胞数计数，1分为1%～24%；2分为25%～49%，3分为50%～74%为，75%以上为4分。②镜下细胞胞质染色强度评分：0分：细胞胞质无染色；1分：细胞胞质染色呈淡黄色颗粒、较背景明显偏高；2分：细胞胞质染色为胞质颗粒呈浅棕黄色；3分：镜下细胞胞质內呈现较多深棕黄色颗粒；将判定阳性细胞数数目比例的得分与细胞胞质染色强度判定得分相加，所得之和<2分判为ANXA3阴性(-)，ANXA3弱阳性(+)为2～3分，ANXA3中度阳性(++)为4～5分，ANXA3强阳性(+++)为6～7分。在本研究中，ANXA3阳性标准定为判定得分在2分以上。
1.3.3 HER-2判定标准[9]：本研究中HER-2判定标准采用美国FDA推荐的HercepTest评分标准，具体如下：镜下观察癌细胞胞膜着色，癌细胞胞膜无着色或少于10%癌细胞胞膜着色的判定为(-)；癌细胞胞膜着色>10%，着色微弱、染色不完整判定为(+)；癌细胞胞膜着色>10%，且呈现细胞膜着色中等完整、着色弱的判定为(++)；癌细胞胞膜着色>10%，且呈现细胞膜着色完整、着色强的判定为(+++)。在本研究中将(-)～(+)定义为HER-2低表达，(+++)定义为HER-2高表达，HER-2判定为(++)者再进一步做FISH检测，依据观测到的红色信号的总数与绿色信号的总数比值作为判断是否存在HER-2基因扩增标准：存在RHE-2基因扩增为两种不同颜色信号总数比值≥2；两种不同颜色信号总数比值<2为无扩增。FISH检测判定为存在HER-2基因扩增计为HER-2高表达，FISH检测判定为无HER-2基因扩增计为HER-2低表达。在本研究中判定HER-2时镜下癌细胞胞质着色不计入结果；病理为乳腺导管内癌的病例不计入HER-2判定结果，本研究只判定乳腺浸润性癌的HER-2情况。
1.3.4 Ki67结果判定[10]：Ki67判定应为癌细胞胞核染色，阳性细胞为癌细胞胞核棕色着色，需计数镜下每5个高倍视野，计算阳性细胞所占百分率为Ki67结果。
1.3.5 分子分型标准[11]：根据2013年St.Gallen共识乳腺癌分子分型标准：根据乳腺癌免疫组化检测结果将乳腺癌分为4型。同时满足ER和PR阳性(PR≥20%)，HER-2阴性，Ki-67低表达(<14%)判定为乳腺癌luminal A型；ER阳性，PR阳性低表达(<20%)或HER-2阳性或Ki-67高表达(≥14%)判定为乳腺癌lumianl B型；HER-2阳性并且ER和PR阴性判定为HER-2过表达型。ER、PR，HER-2三者均为阴性判定为乳腺癌基底样型(三阴型)。
1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，2组比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ANXA3蛋白表达率 本研究通过免疫组化检测显示ANXA3 2分以上患者共96例，阳性表达率为62.7%。见图1、2。
图1 ANXA3在乳腺癌中阴性染色(免疫组化×20)
图2 ANXA3在乳腺癌中强阴性染色(免疫组化×40)
2.2 ANXA3蛋白表达与年龄的关系 本研究将患者根据年龄分为<50岁组及≥50岁组，结果显示ANXA3在两组中阳性表达率分别为61.11%及64.20%，经统计学比较，2组患者差异无统计学意义(χ2=0.155，P=0.693)。见表1。
2.3 ANXA3蛋白表达与月经状态的关系 根据患有无绝经情况将患者分为绝经前组和绝经后组，结果显示ANXA3 在2组中阳性表达率分别为65.38%及58.67%，经统计学比较，2组患者差异无统计学意义(χ2=0.474，P=0.491)。见表1。
2.4 ANXA3蛋白表达与肿瘤大小的关系 根据AJCC分期标准中肿瘤大小的分组将患者分为T≤2 cm，2 cm
2.5 ANXA3蛋白表达与临床分期的关系 根据AJCC分期标准将患者分为Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期组，ANXA3 在3组中阳性表达率分别为62.96%、61.47%及70.59%，经统计学比较，3组患者ANXA3 阳性表达差异无统计学意义(χ2=0.524，P=0.770)。见表1。
2.6 ANXA3蛋白表达与分子分型的关系 根据St.Gallen分子分型将患者分为Luminal A、Luminal B、HER-2型及三阴型4组，结果显示ANXA3 在四种亚组中阳性表达率分别为46.87%、56.16%、58.82%及80.65%，经统计学比较，ANXA3 在三阴型乳腺癌患者中阳性表达率明显高于其它亚组患者(χ2=8.207，P=0.042)，但在其他亚组之间ANXA3表达无统计学差异(χ2=0.951，P=0.622)。见表1。
2.7 ANXA3蛋白表达与淋巴结转移的关系 根据AJCC分期标准中腋窝淋巴结转移状态将患者分为0、1～3、>3枚转移3组，结果显示ANXA3在3组中阳性表达率分别为52.30%、66.67%、76.47%，经统计学比较，ANXA3 在腋结阳性数>3个患者中阳性表达率明显高于其他患者(χ2=7.549，P=0.023)。见表1。
2.8 ANXA3蛋白表达与肿瘤组织学分级的关系 根据肿瘤组织学分级分为Ⅰ级、Ⅱ级及Ⅲ级3组，ANXA3在3组中阳性表达率分别为29.41%、65.26%及70.73%，随着组织学分级的增高，ANXA3蛋白阳性表达率逐步提高且差异有统计学意义(χ2=9.457，P=0.009)。见表1。
表1 乳腺癌组织中Annexin A3 的表达与临床病理关系
3 讨论
膜联蛋白(Annexins)是一类结构上与磷脂相结合的蛋白超家族，其具有钙离子依赖性，占细胞总蛋白的约2%[12,13]，参与细胞骨架组成并可以调控细胞与细胞外基质相互作用。ANXA3是Annexins家族成员之一。研究表明，ANXA3基因定位于人染色体4q13～q22，由323个氨基酸残基组成[14,15]。
本研究结果显示免疫组化检测ANXA3在乳腺癌组织中表达率为62.7%，明显高于正常组织。并且其在腋结阳性数>3个的34例患者中，ANXA3表达率高达76.47%，明显高于腋结阴性的患者中的表达率52.30%且差异有统计学意义(χ2=7.549，P=0.023)，提示ANXA3表达与淋巴结转移状态呈正相关。Zeng等[16,17]研究结果同样显示ANXA3表达与腋淋巴结转移呈正相关性。并且本研究中显示ANXA3的高表达与组织学分级呈正相关性(P=0.009)，提示ANXA3可能参与乳腺癌的发生发展及转移，并与预后相关。国内外文献报道关于ANXA3在乳腺癌中的表达相关研究较少，而其在肺癌、肝癌当中的表达研究较多，并且均提示在肺癌、肝癌中有淋巴结转移的癌组织中ANXA3的表达显著高于未有淋巴结转移的癌组织[5,18]，而本研究同样发现ANXA3的表达在淋巴结转移的乳腺癌患者中显著高于淋巴结阴性的患者，提示ANXA3可能促进了肿瘤的转移。
本研究还对比了ANXA3的表达与患者年龄、月经状态、肿瘤大小及临床分期的相关性，结果显示ANXA3的表达与以上因素无相关性(P>0.05)。
本研究首次发现ANXA3在乳腺癌不同的分子分型中表达存在差异性。在分析ANXA3在乳腺癌不同分子分型中的表达时发现：在三阴性乳腺癌中ANXA3的表达明显高于其他3组(LuminaA型、LuminaB型、HER-2阳性型)，而大量的研究表明三阴性乳腺癌的预后较其他类型差，提示ANXA3的表达可能与预后存在相关性，提示ANXA3可能参与乳腺癌的发生、发展及转移过程，将有可能成为判断乳腺癌浸润、转移和预后的用价值的标记物。至于ANXA3在分子水平促进肿瘤细胞增殖、转移的具体机制还有待于进一步研究。
综上，ANXA3的表达与乳腺癌的淋巴结转移状态、组织学分级以及分子分型存在统计学差异，淋巴结转移个数越多，组织学分级越高，ANXA3的表达越高，提示ANXA3可能促进肿瘤细胞的增殖及转移。而在预后较差的三阴性乳腺癌患者中，ANXA3表达明显增高，提示ANXA3可能与预后存在相关性，还需要进一步的随访证实。我们期望在进一步的蛋白水平及分子水平对ANXA3在乳腺癌中的表达进行研究，期望进一步得到ANXA3在分子水平促进肿瘤细胞增殖、转移的具体机制，以期为乳腺癌的诊治提供分子水平依据。
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10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.012
050011 石家庄市，河北医科大学第四医院乳腺中心(周涛、李春晓)，外科(李勇)，CT MR科(杨丽)，病理科(王占东、刘月平)
R 737.9
A
1002-7386(2016)22-3409-04
2016-04-06)
