β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞A549的增殖影响

胡美琴 高琨 唐昃 龚军



·论著·

β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞A549的增殖影响

胡美琴 高琨 唐昃 龚军

目的 观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法 利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法分析转染细胞的增殖情况。结果 经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢(P< 0. 05)。结论 β-arrestin2基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。

β-arrestin2；肺腺癌；A549细胞；细胞增殖

目前肺癌在男性肿瘤死因中已居首位，其 5 年生存率仅为8%～11%，30%的肺癌患者诊断时已有远处转移，50%～60%肺癌患者在治疗过程中发生远处转移[1]。肺癌是一种常见的严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。近年来肺癌的发病率和病死率逐步增加,已成为全世界发病率和病死率最高的癌症之一。多种基因参与肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁徙等生物学行为的调控，研究相关基因与肺癌细胞生物学行为的关系、阐明肺癌远处转移的分子机制、寻求有效的治疗靶点，对改善肺癌患者的预后具有重要意义。NF-κB是一类参与免疫炎性反应、细胞增殖分化、细胞周期以及凋亡的多功能转录调控因子[2]。许多实验资料表明,在人类肿瘤中，NF-κB家族基因存在扩增、移位等现象,而引起NF-κB促进基因转录的活性增强,结果导致某些控制细胞转化的关键靶基因转录增强[3]。有研究表明NF-κB亚单位P65在肺癌中阳性率高达71.4%,明显高于癌旁支气管上皮和肺泡上皮细胞[4]。β-arrestin是一种重要的支架蛋白,由β肾上腺素受体激酶(βARK)纯化，在G蛋白偶联受体(GPCR)的信号传导中起重要作用[5, 6]。GPCR活化后，MDM2和β抑制蛋白的相互结合，以形成具有GPCR的磷酸化的三聚体和介导受体的内吞作用的过程[7-9]。研究表明，β-arrestin是一种肿瘤因子，为内源核因子-κB(NF-κB)的负调控蛋白[10, 11]。NF-κB是一种重要的核转录因子，广泛存在于细胞质中。 NF-κB可以呈递亚基P65，BMP2，MSX2，和RUNX2的表达。β-arrestin2可以通过激活NF-κB来调节炎症和血管生成[12-14]。目前β-arrestin2基因在肺癌发生发展中的作用及对P65表达的影响的报道笔者所见少见。本实验应用脂质体转染技术将β-arrestin2基因导入A549细胞,分析外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549生长的影响,探讨β-arrestin2基因在肺癌中的作用及其机制。本研究以携带β-arrestin2基因的重组慢病毒颗粒和未携带目的基因的空载体慢病毒颗粒分别感染 A549细胞,用G418筛选法建立稳定细胞株，以RT-PCR和 Western blotting 方法分别检测感染后目的基因mRNA和蛋白质表达以确认获得稳定高表达β-arrestin2基因的A549细胞。并运用 MTT法观察β-arrestin2基因对A549 细胞体外增殖的影响。以期阐明该基因对于肺腺癌生物学行为影响的具体分子机制，为本病的生物治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:人肺腺癌细胞系A549购自中科院上海细胞生物研究所，用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640培养基在37℃,5% CO2的培养箱中培养。

1.1.2 试剂:质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司,RT-PCR试剂盒、限制性核酸内切酶BamHⅠ,XbaⅠ购自Ferments公司;脂质体购自Invitrogen公司;鼠抗人β-arrestin2抗体购自Santa Cruz Biotechnology;G418,Trizol,DEPC购自上海生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒的小量提取及酶切鉴定:将pcDNA3.1-β-arrestin2质粒转化TG1感受态,常规铺板,挑取菌落扩增,采用质粒抽提试剂盒提取质粒,应用限制性内切酶BamHⅠ,XbaⅠ双酶切鉴定质粒。

1.2.2 质粒转染:以每孔5×105个细胞的密度将A549细胞接种于6孔板中,培养至80%融合时,应用脂质体按说明书进行转染,实验分为3组:未转染组、转染空白质粒(pcDNA3.1)组和转染阳性质粒(pcDNA3.1-β-arrestin2)组。质粒转染48 h后,换含800 μg/L G418的选择培养基培养4 d,再换含300 μg/L G418的选择培养基维持筛选至出现细胞克隆,挑取细胞克隆扩大培养备用。

1.2.3 定量RT-PCR检测β-arrestin2 mRNA表达的变化:RNA提取按照trizol试剂盒操作指南进行，反转录依照试剂盒操作说明书进行，总反应体系为25 μl，反转录条件为42℃反应60 min，β-arrestin2引物：forward primer:5'-CCCTGGATGGGAAACTCAAG-3';reverse primer: 5'-AGG ATTCCCAGCACCTCCTT-3'；β-actin: forward primer:5'-CCACGAAA CTACCTTCAACT-3';reverse primer: 5'-TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC-3'。cDNA产物直接取2 μl加入PCR反应体系进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性30 s,55℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环后，72℃维持10 min，反应结束后，记录下他们的ct值。

1.2.4 Western blot 检测β-arrestin2蛋白表达的变化:分别收集转染后稳定表达的各组细胞，用预冷的PBS洗涤，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，用Bradford 法测定蛋白质浓度。分别取50 μg蛋白，变性后经5%SDS-PAGE浓缩胶和10%SDS-PAGE分离胶电泳，电泳完后取出凝胶转膜，将凝胶置于转移缓冲液中平衡20 min，半干后转印蛋白到PVDF膜上，脱脂奶粉室温震荡封闭90 min，孵一抗，4℃过夜。加辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，37℃室温孵育1 h。取等量ECL显示试剂A、B液混匀后孵育PVDF膜，曝光显影。以β-actin为内参。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖:将稳定表达系对数生长期的A549细胞制备成单细胞悬液，以3×103细胞接种于96孔培养板内，加入培养液200 μl，每组设6个复孔，37℃、5%CO2孵箱中培养，分别培养24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液 20 μl，37℃、5%CO2孵箱中继续培养4 h，弃去孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，酶标仪下490 nm波长处读取吸光度值(A)。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标取平均值绘制生长曲线。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示,多组比较采用单因素方差分析,计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒酶切鉴定 pcDNA3.1-β-arrestin2质粒经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切,得到了大小与pcDNA3.1质粒相符的5.4 kb大片段和与目的基因片段相符的1.1 kb 片段。

2.2 定量RT-PCR检测β-arrestin2 mRNA表达 通过RT-PCR检测β-arrestin2 mRNA在β-arrestin2转染组、阴性对照组、空白对照组细胞中的表达，每一个样本设3个复孔，取平均值为检测结果，以β-actin为内参。根据公式Δct=[ct(目的基因)]-[ct(内参基因)]和ΔΔct=[Δct(研究组)]-[Δct(对照组)]，计算出2-ΔΔct，以反映出目的基因在研究组中表达水平(相对于对照组)。β-arrestin2 mRNA在β-arrestin2转染组中的表达高于阴性对照组、空白对照组细胞中的表达(P<0.05)，而阴性对照组、空白对照组细胞中的β-arrestin2 mRNA的表达无明显差异(P>0.05)。见图1。

图1 β-arrestin2 mRNA在β-arrestin2转染组、阴性对照组、空白对照组中的表达水平

2.3 Western blot 检测β-arrestin2蛋白表达 Western blot 实验结果表明β-arrestin2组的蛋白表达与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组相比没有统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果表明转染β-arrestin2 A549细胞β-arrestin2蛋白表达明显增加。见图2。

图2 Western blot 检测β-arrestin2转染对人肺腺癌A549细胞β-arrestin2基因蛋白水平表达的影响

2.4 β-arrestin2基因转染对A549细胞生长速率的影响 利用MTT法对细胞生长速率进行比较，空白对照组、阴性对照组、β-arrestin2转染组细胞以相同的细胞密度接种进行培养，每天各测一次，共测4 d。空白对照组、阴性对照组、β-arrestin2转染组细胞在生长12、24、48、72 h后的MTT实验结果表明：β-arrestin2转染组细胞的生长速度明显慢于阴性对照组、空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。而阴性对照组、空白对照组中A549细胞的增殖差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图3。

表1 β-arrestin2的表达被干扰后对A549细胞增殖的影响 ±s

表1 β-arrestin2的表达被干扰后对A549细胞增殖的影响 ±s

注：与对照组比较，*P<0.05

组别24h(OD)48h(OD)72h(OD)96h(OD)空白对照组0.176±0.0020.326±0.0060.560±0.0150.838±0.018阴性对照组0.178±0.0060.408±0.0160.572±0.0110.790±0.031β-arrestin2干扰组0.156±0.0040.179±0.009*0.219±0.013*0.345±0.039*

图3 β-arrestin2基因转染对A549细胞生长的抑制作用

3 讨论

随着NF-κB抑制细胞凋亡作用机制的研究深入，并应用于炎症、肿瘤等疾病的治疗，人们发现 NF-κB在不同的刺激因素及特定的细胞类型中还有促进细胞凋亡的作用[15]。Ping等[3]通过酵母菌二次杂交实验证明 NF-κB可与IκBα直接结合，并且通过刺激Hela、HEK293和COS-7细胞系的β2肾上腺素受体(β2AR)而明显增加β-arrestin2的数量[16]。Luan等[17]研究发现β-arrestin2与IκB相互作用可阻止IκB的磷酸化和降解，从而减少紫外线照射引发的 NF-κB信号活化。证明，β-arrestin2是NF-κB的负调控蛋白，抑制NF-κB的信号转导的途径。β-arrestin作为多功能蛋白，能够引起GPCR的脱敏和内吞来调节GPCRs信号转导，结合MAPK JNK3，招募凋亡信号调节激酶1、MEK1和MKK4等上游激酶，增强GPCRs介导的JNK3的激活，与细胞凋亡密切相关[18]。

目前对于肺癌的治疗，临床上采用手术、放疗和化疗等方法创伤大，不良反应重，寻求一种新的微创、不良反应小、可以根治宫颈癌的方法势在必行。本实验将β-arrestin2基因扩增转染A549细胞，在基因水平及蛋白表达水平验证对β-arrestin2的靶向作用。

笔者将β-arrestin2基因转染至人肺腺癌细胞A549,发现与未转染组和空白质粒转染组相比,转染组A549细胞生长速度明显下降。这些结果提示β-arrestin2基因能抑制恶性肿瘤细胞的生长,可能是肺癌的候选抑制基因。结果提示β-arrestin2基因可能对p65基因的转录和翻译过程无显著影响,但可阻止P65由胞浆转入胞核,从而抑制NF-κB的活性。本实验研究显示外源性β-arrestin2基因表达能够抑制人肺腺癌细胞A549增殖。

目前国内外少见关于β-arrestin2基因对肺癌细胞生物学行为影响的相关报道。本研究在以前研究的基础上首次研究了β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞 A549体外增殖的影响。为了解β-arrestin2 基因对肺癌细胞生物学特性影响及其机制，有必要构建β-arrestin2基因高表达的肺癌稳定细胞株。RT-PCR 实验显示各组β-arrestin2 mRNA 表达差异有统计学意义(P<0.05)，Western blotting实验显示β-arrestin2转染组蛋白表达量明显高于 A549 细胞对照组。以上实验结果证实β-arrestin2 mRNA 及蛋白已经在 A549细胞中稳定地高表达。成功地构建β-arrestin2基因过表达的肺腺癌稳定细胞株，是进一步研究该基因对相应癌细胞作用及机制的基础。本研究首次通过MTT实验研究β-arrestin2对于肺腺癌细胞A549体外增殖的影响。结果显示，β-arrestin2转染组在不同时间(1、2、3、4、5 d)MTT法所测吸光度(OD)值与 A549 细胞对照组相比，差异有统计学意义，表明β-arrestin2基因转染能抑制人肺腺癌细胞的体外增殖。今后一方面需要观察β-arrestin2异常表达对其他类型肺癌体外增殖、凋亡及侵袭等生物学行为的效应，另一方面有必要通过后续的体外实验和动物实验来进一步观察该基因对转移的其他环节的影响效应，并进行作用机制的深入研究，以期阐明该基因对于肺腺癌生物学行为影响的具体分子机制，为本病的生物治疗寻找新的靶点。

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Effects ofβ-arrestin2 gene transfection on the proliferation of human pulmonary adenocarcinoma cells A549 in vitro

HUMeiqin*,GAOKun,TANGZe*,etal.DepartmentofOncology,CentralHospitalofHuangshiCity,Hubei,Huangshi435000,China

Objective To observe the effects of exogenous β-arrestin2 gene transfection on the proliferation of human pulmonary adenocarcinoma cells A549 in vitro.Methods The pcDNA3. 1-β-arrestin2 plasmid and and empty carrier-pcDNA3. 1 plasmid were introduced into A549 cells by liposomes transfection technique,then the cell clones that could express stably β-arrestin2 gene were established by G418 screening. The expression levels of β-arrestin2 were detected by RT-PCR and Western Blotting,respectively.The proliferation status of positive clones was observed by methythiazoletertraolium (MTT) assay.Results The A549 cell line that could express stably β-arrestin2 gene was established by liposome transfection and screening.As compared with that in non-transfection group and blank carrier-transfection group,the growth velocity in the cells that were transfected by β-arrestin2 gene was significantly decreased (P<0.05). Conclusion The β-arrestin2 gene can inhibit the growth of of human pulmonary adenocarcinoma cells-A549 in vitro by inhibiting the activity of P65 protein.

β-arrestin2; pulmonary adenocarcinoma; A549 cells; cell proliferation

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.001

项目来源：湖北省黄石市医药卫生科研立项项目(编号：201402)

435000 鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)腹盆肿瘤内科(胡美琴、唐昃、龚军)，骨科(高琨)

龚军，435000 鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)腹盆肿瘤内科；

E-mail:32218934@qq.com

R 734.2

A

1002-7386(2016)22-3365-04

2016-03-19)