PI3K-AKT-mTOR信号通路在大鼠肺性脑病模型神经元自噬中的作用

曾凡军 周媛媛 熊晓琦 阮玉姝 赵必君 万晓蓉

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院，湖北 宜昌 443000)



PI3K-AKT-mTOR信号通路在大鼠肺性脑病模型神经元自噬中的作用

曾凡军 周媛媛 熊晓琦 阮玉姝 赵必君 万晓蓉

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院，湖北 宜昌 443000)

目的 探讨PI3K-AKT-mTOR信号通路在肺性脑病神经元自噬中的作用。方法 对36只新生健康SD大鼠乳鼠建立离体培养大鼠皮层神经元，随机分为空白对照组、肺性脑病组、自噬抑制剂3-MA组后进一步建立了大鼠肺性脑病细胞模型，借助该模型运用CCK8法检测神经元活力、MDC染色观察神经元自噬泡数量、Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表达。结果 与空白对照组比较，肺性脑病组神经元活力降低 (P<0.05)；神经元自噬泡数量增多；LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、Beclin-1及磷酸化PI3K表达水平增加(P<0.05)。使用自噬抑制剂3-MA预处理后，神经元活力降低更明显、自噬泡数量明显减少；缺氧诱导的自噬水平明显受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、 Beclin-1及磷酸化PI3K表达水平明显降低。结论 缺氧和二氧化碳潴留的信号使Beclin-1表达增加、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增加，加速PI3K磷酸化，使PI3K-AKT-mTOR信号通路失活，从而激活自噬信号通路，导致大脑神经元自噬增强。

肺性脑病；神经元自噬；PI3K-AKT-mTOR信号通路

肺性脑病是因呼吸衰竭导致低氧血症和高碳酸血症而出现神经精神症状的一种临床综合征，是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者严重的并发症，病死率极高。大脑神经元自噬可能是其发病机制之一，PI3K-AKT-mTOR信号通路参与神经元自噬。本文探讨神经元自噬与肺性脑病之间的相关性。

1 动物和方法

1.1 动物及分组 三峡大学医学院实验动物中心提供36只新生24 h内健康SD大鼠乳鼠。首先进行皮层神经元的培养及鉴定；培养5 d后进行缺氧实验改良。随机分为空白对照组、肺性脑病组、自噬抑制剂3-MA组。肺性脑病组神经元造模后取培养液上清，采用全自动生化分析仪器进行血气分析。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠皮层神经元的培养 用75%酒精棉球擦拭乳鼠皮肤灭菌两次，每次2 min，无菌环境下开颅分离双侧皮层，置预冷PBS 液中洗涤三遍去除血液，然后转入安培瓶中，眼科剪剪碎。用含2%B27的Neurobasal培养基培养，之后每2天全量换液1次，取培养5 d的皮层神经元用于实验。

1.2.2 乳鼠皮层神经元纯度鉴定 细胞种板培养后第5天， 4%多聚甲醛进行预处理，MAP-2抗体标记皮层神经元胞质蛋白，Hochest33258进行细胞核染色。抗淬灭剂封片后，激光共聚焦显微镜下采集图片。参照文献进行大鼠皮层神经元纯度鉴定〔1〕。

1.2.3 CCK8法检测神经元活力 皮层神经元种植于96孔板，每组设6个复孔，施加处理因素后，于培养结束的最后4 h每孔加入20 μl CCK8溶液，每孔内总体积为200 μl，37℃继续孵育6 h。酶标仪测定吸光度值。细胞存活率= (干预孔OD值-正常对照组OD 值均值)×100%。

1.2.4 MDC染色 弃去6孔板内的Neurobasal/B27培养基，PBS洗涤细胞两次，加入2 ml含MDC的Neurobasal/B27(MDC终浓度为100 μmol/L)，置37℃培养箱中继续培养1 h，弃培养基，PBS洗涤3次后每孔加入1 ml PBS，荧光显微镜下摄片。

1.2.5 Western印迹检测自噬相关蛋白 使用自噬抑制剂3-MA预处理神经元，然后缺氧4 h，检测LC3-Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1及PI3K在各组神经元中的表达水平。对培养神经元不同时间段曝光图片，选取合适图片。Image-ProPlus 6.0软件分析结果，目的条带与GAPDH 条带灰度比值为蛋白质相对含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行t检验、单因素方差分析LSD法。

2 结 果

2.1 大鼠皮层神经元鉴定 大鼠皮层神经元种植培养2 d后，神经元胞体变大，呈梭形，突起进一步增多、延伸 (图1A)；培养5 d后，神经元胞体圆润丰满，光晕明显，突起相互交联，形成神经网络，突起细长多为2～4个 (图1B)。激光共聚焦显微镜下，MAP-2/Cy3红色荧光标记的神经元占总细胞数的90%以上，胞体和突起均被染色，胞体圆满，突触生长良好。

(A)瑞士-吉姆萨染色,倒置显微镜下图像；(B)MAP-2/Hochest33258染色，激光共聚焦显微镜下图像：经免疫荧光法染色后神经元胞体和突起呈红色，细胞核呈蓝色，箭头示神经元图1 培养5 d的大鼠皮层神经元

2.2 肺性脑病组神经元培养液血气分析结果 培养液氧分压为(10±2)mmHg，二氧化碳分压为(70±20)mmHg，pH为(7.10±2.34)，与临床肺性脑病患者血气分析结果基本一致，表明肺性脑病造模成功。

2.3 三组神经元活力比较 与空白对照组比较，肺性脑病组神经元活力降低〔(85±10)% vs (98±8)%，P<0.05〕；与肺性脑病组比较，3-MA组神经元活力降低〔(21±69)%,P<0.05〕，提示缺氧及二氧化碳潴留可诱导神经元死亡；使用自噬抑制剂后，神经元死亡率增加，提示自噬是一种保护性反应。

2.4 三组神经元自噬泡MDC染色比较 与空白对照组比较，肺性脑病组神经元自噬泡数量增多(P<0.05)。使用自噬抑制剂3-MA预处理后，自噬泡数量明显减少(P<0.05)，说明缺氧诱导的自噬水平明显受到抑制。见图2。

图2 三组神经元MDC染色图像和自噬泡数量(10 μm)

2.5 三组神经元LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表达比较 肺性脑病组中，Beclin-1及磷酸化PI3K表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增加(P<0.05)。使用自噬抑制剂3-MA预处理后，缺氧诱导的自噬水平明显受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值及 Beclin-1及磷酸化PI3K表达水平明显降低。见图3。

1～3:空白对照组、肺性脑病组、3-MA预处理组图3 Western印迹检测三组神经元LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表达

3 讨 论

目前较为普遍的观点认为自噬通常促进细胞存活，可保护细胞在长时间的饥饿或者其他刺激状况下存活〔2〕。缺氧及二氧化碳潴留可诱导神经元死亡，神经元活力降低；使用自噬抑制剂后，神经元死亡率增加，提示自噬是一种保护性反应。

MDC是一种绿色荧光染料，常用于自噬泡的示踪剂，在荧光显微镜下可从形态学直观观察活细胞内自噬的变化〔3〕。本研究采用MDC染色发现：肺性脑病组神经元自噬泡数量增多，使用自噬抑制剂3-MA预处理后，缺氧及二氧化碳潴留诱导的神经元自噬水平明显受到抑制。LC3蛋白有两种存在形式，即LC3-I和LC3-Ⅱ〔4〕。自噬过程中，LC3-I与脑磷酯结合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/LC3-I比值与细胞自噬水平呈正比〔5〕。本研究表明神经元模拟肺性脑病条件下，神经元自噬增强，可以延缓或阻止神经元死亡。使用特异性自噬抑制剂后，神经元自噬减弱。Aita等〔6〕于1999年成功克隆了Beclin-1。Arsov等〔7〕发现Beclin-1广泛表达于各组织的细胞质中。Beclin-1基因是介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键基因，参与哺乳动物自噬体形成的调控〔8〕。Beclin-1表达增强可作为评价自噬水平升高的重要指标。同时Beclin-1是酵母Atg6的同源体，表达于反面高尔基网状结构,与Ⅲ型PI3K和Atgl4L结合形成复合体,调控自噬前体产生和自噬体形成〔8〕。本研究发现，肺性脑病神经元模型中，Beclin-1表达升高，使用3-MA后，Beclin-1表达降低。PI3K磷酸化Ptdlns4P和Rdlns(4,5)PZ，生成PtdIns(3,4)PZ和PtdIns(3,4)两种蛋白。这两种蛋白结合AKT/PKB、PDK1，抑制自噬的发生，是自噬的负调节分子，PI3K为mTOR路径的一部分〔2〕。PI3K-AKT-mTOR信号通路通过协调其下游蛋白的磷酸化，调节蛋白的合成、细胞周期的进展、细胞的代谢以及转录因子，从而控制细胞的生长、增殖、凋亡和自噬〔9〕。本研究发现在缺氧及高二氧化碳情况下，自噬发生依赖于PI3K磷酸化程度。

1 Gong Z,Yang LJ,Tang HM,etal.Protective effects of curcumin against human immunodeficiency virus 1 gp120 V3 loop-induced neuronal injury in rats〔J〕.Neural Regene Res,2012；7(3):171-5.

2 Yonekawa T,Thorburn A.Autophagy and cell death〔J〕.Essays Biochem,2013；55(1):105-17.

3 Balduini W,Carloni S,Buonocore G.Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury〔J〕.J Matern Fetal Neonatal Med,2012；25(Suppl 1)：30-4.

4 Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,etal.LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing〔J〕.EMBO J,2000；19(21):5720-8.

5 Karim MR,Kanazawa T,Daigaku Y,etal.Cytosolic LC3 ratio as a sensitive index of macroautophagy in isolated rat hepatocytes and H4-II-E cells〔J〕.Autophagy,2007；3(6):553-60.

6 Aita VM,Liang XH,Murty VV,etal.Cloning and genomic organization of beclin 1,a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21〔J〕.Genomics,1999；59(1):59-65.

7 Arsov I,Li X,Matthews G,etal.BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development〔J〕.Cell Death Differ,2008；15(9):1385-95.

8 Pattingre S,Espert L,Biard-Piechaczyk M,etal.Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes〔J〕.Biochimie,2008；90(2):313-23.

9 Shaw RJ,Cantley LC.Ras,PI (3) K and mTOR, signalling controls tumour cell growth〔J〕.Nature,2006；441(7092):424-30.

〔2015-06-23修回〕

(编辑 曹梦园)

曾凡军(1968-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事呼吸系统疾病研究。

R747.9

A

1005-9202(2016)21-5247-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.014