促红细胞生成素对内毒素所致大鼠肾脏线粒体损伤的保护作用

张国兴 齐 力 李晓华 赵 辉 孙 霓 孙 宇 李秀江

(吉林省肿瘤医院ICU科，吉林 长春 130012)



促红细胞生成素对内毒素所致大鼠肾脏线粒体损伤的保护作用

张国兴 齐 力1李晓华2赵 辉 孙 霓 孙 宇 李秀江

(吉林省肿瘤医院ICU科，吉林 长春 130012)

目的 利用建立脂多糖(LPS)大鼠内毒素血症导致肾脏损伤模型观察促红细胞生成素(EPO)防治脂多糖对肾脏造成损害的机制。方法 随机选取成年Wistar大鼠30只，采用等组实验法分为空白对照组、脂多糖(LPS)组以及联合(LPS+EPO)组。除空白对照组以外，其余两组分别注射LPS 10 mg/ml，采取尾静脉注射建立肾脏损伤模型，空白对照组给予同等量生理盐水，30 min后，LPS+EPO组给予rhEPO(5 000 U/kg)经尾静脉注射。其余2组大鼠给予生理盐水。在LPS注射后24 h处死大鼠，分离提取肾脏组织线粒体，用 Clark 氧电极法检测线粒体呼吸功能，线粒体内、外膜试剂盒测定线粒体膜完整性，一氧化氮(NO)试剂盒测定线粒体NO含量，电镜扫描观察线粒体形态变化。结果 LPS组和LPS+EPO组的线粒体外膜完整率、内膜膜电位、呼吸控制率均较空白对照组明显降低(P<0.01)，LPS+EPO组上述结果均高于LPS组(P<0.05)；LPS组线粒体NO含量明显高于空白对照组(P<0.01)，LPS+EPO组低于LPS组(P<0.01)，电镜扫描见LPS组线粒体结构受损明显，EPO减轻线粒体结构损伤。结论 EPO对内毒素导致的肾脏线粒体损伤有保护作用，可能与EPO抑制NO生成有关。

促红细胞生成素；内毒素；肾损伤；线粒体

据不完全统计表明，每天有1万多人死于感染疾病，而被感染人群的比率每年高达8%〔1〕。绝大多数被感染的患者肾脏功能破坏是造成死亡的首要原因。肾脏是重症感染所致多脏器损伤中最常受累及的脏器之一，急性肾衰竭的发病率可高达40%～50%〔2〕。促红细胞生成素(EPO)对内毒素所致肾脏损伤具有保护作用〔3〕，本研究探讨EPO对于脂多糖(LPS)所致大鼠急性肾损伤的肾脏线粒体的保护作用。

1 材料及方法

1.1 动物及主要试剂 Wistar成年大鼠30只，雌鼠15只，雄鼠15只，重量最大为250 g，所有的大鼠均有合格证明，证号为：scxk(吉)2008-0005，由吉大实验动物中心提供，大鼠供养温度22℃～24℃，并保证大鼠的吃食正常，此次研究的相关内容以及规定均已经通过审查。重组人EPO的批号为(20071102V；100 000 IU/支)，是由沈阳三生制药所生产的。LPS(Sigma-L2880；≥99%) 上海Sigma公司。Percoll 细胞分离液 Pharmacia17-0891-01(MK 02742)由日本邮购，IMM以及外膜功能检测盒的生产公司为上海杰美基因医药科技有限公司，NO试剂盒购于南京建成生物医药有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立及标本采集 对实验大鼠饲养7 d，并按照基础适应性方法进行饲养，7 d后开始进行实验，采用等组实验法，平均分为空白对照组、LPS组以及联合(LPS+EPO)组，每组各10只。除空白对照组外，其余两组各尾静脉注射含量为10 mg/ml的LPS〔4〕。注射LPS后，等待0.5 h，LPS+EPO组尾静脉注射含量为5 000 U/kg的重组人红细胞生成素，空白对照组以及LPS组注射等量氯化钠溶液，LPS注射后24 h，乙醚吸入麻醉后处死。取右侧新鲜肾脏组织用于线粒体提取，左侧肾脏组织2.5%戊二醛固定。

1.2.2 肾脏线粒体提取 取肾脏组织，最重为500 mg，将其转移到冰冷的mitochondrion分离缓冲液之中，进行实验时，应用的所有设备以及缓冲液都要控制冰冷度，以4℃为最佳，所采用的试样要将其放置在3.6 ml 12%的Percoll分层液中搅拌均匀，并使用匀浆器均匀搅动，以10次为最佳，且使用的匀浆器直径应为0.12 mm，并再次用直径0.06 mm的匀浆器搅拌，数量与之前一致。获得mitochondrion的方式选择Percoll密度梯度离心法〔3〕，加入分离介质重悬mitochondrion，按照1∶0.4的体积，并放置于冰槽中，等待检查。

1.2.3 mitochondrion呼吸功能测定 使用Respiration Measurement法，在反应槽中放置2.5 ml的反应溶剂(225 mmol/L D-木蜜醇，70 mmol/L白砂糖，1 mmol/L乙二胺四乙酸，0.1%牛血清白蛋白，10 mmol/L磷酸三钾，ph=7.4，设置温度25℃)，将所有物质充分搅拌均匀，当基本氧浓度为240 μmol/L时，则状态平衡。将含量为2 mg的线粒体悬液进行60 s的孵育。将4 mmol/L的Disodium Succinate放置，耗氧速率为4态呼吸。将50 mmol/L的二磷酸腺苷加入，测定耗氧速率为3态呼吸。4态呼吸和3态呼吸分别为R3和R4，新鲜提取的线粒体，按照检测试剂盒说明书进行检测线粒体膜完整性及NO含量。

1.2.4 线粒体超微结构 记录2.5% C5H8O2已经固定的肾组织，进行1% OsO4后加固，梯度酒精脱水，Epoxy resin包埋，使用型号为LKB-Ⅲ的超薄切片机进行切片，醋酸氧铀以及C6H5O7Pb双上色。完成上述过程后，使用规格为JEM-1200EX透射式电子显微镜，对线粒体的结构变化进行记录。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 线粒体呼吸功能对比 LPS+EPO组、LPS组R3及RCR相比于空白对照组差异显著(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+EPO组R3和RCR值升高(P<0.05)。见表1。

2.2 线粒体内外膜完整性对比及NO含量mitochondrion完整性和内膜膜电位荧光对比 与LPS组比较，外膜完整率及内膜膜电位荧光比值升高(P<0.05)。LPS组NO含量明显高于空白对照组(P<0.01)，LPS+EPO组低于LPS组(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠肾脏线粒体呼吸功能比较

与空白对照组比较：1)P=0.003，2)P= 0.001；与LPS组比较：3)P=0.009，4)P=0.019

表2 各组大鼠肾脏线粒体膜完整性比较及NO含量比较

与空白对照组比较:1)P=0.005，2)P= 0.008，3)P=0.000;与LPS组比较:4)P=0.017，5)P=0.038，6)P=0.010

2.3 电镜形态观察 LPS组肾脏线粒体明显肿胀，线粒体内腔扩大，嵴数量减少，模糊紊乱，部分嵴消失或空泡化，LPS+EPO组肾脏线粒体损伤有不同程度的缓解，线粒体肿胀减轻，嵴致密排列较整齐，部分嵴模糊，排列尚规则。见图1。

图1 各组大鼠肾脏线粒体电镜扫描结果(×10 000)

3 讨 论

线粒体是细胞维持生命的重要细胞器，由内膜、外膜和基质组成，是三磷酸腺苷(ATP)形成的主要场所，是机体的 “能量工厂”。ATP生成的主要方式是氧化磷酸化，电子在内膜呼吸链中传递。内毒素所致的重症感染导致脏器功能障碍的机制十分复杂，线粒体功能障碍在发病机制中的作用越来越受到重视。本研究结果表明，LPS可以导致肾脏线粒体损伤，主要表现在线粒体呼吸功能显著降低，线粒体膜的完整性遭到破坏，电镜扫描下线粒体肿胀，嵴结构破坏明显。

重症感染时，LPS使用TOLL样受体，将肿瘤坏死因子-α诱发出，在此过程中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和其受体-1相联合，使其1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶异常开放，同时加速活性氧(ROS)的产生，最终导致线粒体氧化应激损伤〔5〕。因此TNF-α与感染性休克诱导的线粒体功能障碍有着密切关系〔6〕。

本研究组既往的研究〔3〕表明EPO对丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)的活化进行遏制，将核转录因子(NF-κB)表达有效减少，真正的控制TNF-α的表达，来保护重症感染导致的急性肾损伤，万芳等〔7〕的研究表明EPO降低重症感染时组织NO的产生。本研究中，给予LPS建立重症感染模型后，再给予EPO保护脏器治疗，线粒体呼吸功能显著改善，R3和RCR值升高，线粒体膜完成性明显提高，电镜扫描证实线粒体超微结构损伤明显减轻。NO含量较LPS组降低。

综上所述，EPO可以保护LPS导致的肾脏线粒体破坏，调节线粒体呼吸功能，其机制可能与EPO抑制TNF-α表达和减低NO生成有关。

1 Mayr FB，Yende S，Angus DC.Epidemiology of severe sepsis〔J〕.Virulence，2014；5(1)：4-11.

2 刘晓伟，刘 志.严重脓毒症并发急性肾衰竭患者92例临床研究〔J〕.中国全科医学，2010；13(7)：738-40.

3 张国兴，李晓华，赵 辉，等.促红细胞生成素对脂多糖所致大鼠肾损伤的保护作用〔J〕.中华实验和临床感染病杂志(电子版)，2014;8(6)：5-9.

4 刘 彤，李 哲，毕晓颖.新生大鼠脑组织中线粒体的分离〔J〕.中国实验诊断学，2011;15(6)：1006-7.

5 Siepe M，Goebel U，Mecklenburg A，etal.Pulsatile pulmonary perfusion during cardiopulmonary bypass reduces the pulmonary inflammatory response 〔J〕.Ann Thorac Surg，2008;86(1)：115-22.

6 Víctor VM，Esplugues JV，Hernandez-Mijares A,etal.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis：a potential therapy with mitochondria-targeted antioxidants〔J〕.Infect Disord Drug Targets，2009;9(4)：376-89.

7 万 芳，吴 俭，汪翠婷，等.重组人促红细胞生成素对感染性休克大鼠脑组织的保护作用〔J〕.南昌大学学报(医学版)，2011;5(3)：1-4.

〔2015-10-10修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林省卫生厅科研项目(No.2012Z067)

李秀江(1961-)，男，教授，主要从事危重病研究。

张国兴(1985-)，男，硕士，主治医师，主要从事危重病研究。

R6

A

1005-9202(2016)21-5230-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.006

1 长春市朝阳区医院 2 吉林大学第一医院感染科